胸膜肺炎放线杆菌apxⅰa基因的克隆、表达及免疫原性研究

胸膜肺炎放线杆菌 apx A基因的克隆、表达及免疫原性研究研 究 生： 富 亮 指导教师： 赵玉军 教授 徐福洲 博士 专业名称： 预防兽医学 研究方向： 动物传染病学 所在学院： 畜牧兽医学院 胸膜肺炎放线杆菌 apx A基因的克隆、表达及免疫原性研究第一章 前 言 第二章 apx A基因的克隆与原核表达第三章 apx A表达蛋白的免疫原性研究猪传染性胸膜肺炎概况猪传染性胸膜肺炎（ Porcine contagious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（ Actinobacillus pleuropneumoniae， APP）引起的猪的呼吸道疾病，其病理特征是引起肺脏广泛的纤维素性渗出、坏死、出血、胸膜粘连，中性细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞的浸润，血管栓塞，纤维素沉积等。各种年龄猪对该病均易感，新疫区常急性爆发，急性感染尤其是 24 25日龄仔猪感染后表现出极高的发病率和死亡率，发病仔猪迅速死亡，死亡率达到 20以上，最急性型可达 80 100 ，并且长期带菌而成为传染性胸膜肺炎再次爆发和流行的潜在传染源，给本病的控制和根除带来困难。同时本病在临床上常与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。该病是国际上公认的危害现代养猪业的重大疫病之一。胸膜肺炎放线杆菌概述胸膜肺炎放线杆菌（ Actinobacillus pleuropneumoniae APP），属于巴氏杆菌科（ Pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus）。 APP是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜，有菌毛，不形成芽胞，无运动性，最近还发现该菌有鞭毛。胸膜肺炎放线杆菌分两个生物型，即生物 型和生物 型，生物 型为辅酶 （烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ Nicotinamide Adenine Dinucleotide， NAD）依赖型，生物 型为非 NAD依赖型。血清型是根据 APP表面荚膜和脂多糖抗原性的不同来划分的，现已发现 15种血清型， 1型 -12型、 15型属于生物 型， 13、 14型属于生物 型。 APP菌体形态（ G ）APP主要毒力因子溶血素（ Apx毒素）脂多糖（ LPS）荚膜多糖 (CPS)外膜蛋白 (OMP)尿素酶 (Urease)转铁结合蛋白（ Tbp）粘附素溶血外毒素 （ Apx毒素）APP产生的溶血外毒素 Apx被认为是 APP最重要的毒力因子。在 APP的 15个血清型中，目前已发现产生四种不同的溶血毒素（Repeats in the structural toxin， RTX），称为Apx（ Actinobacillus pleuropneumoniae- RTX-toxin， Apx），即 Apx 、 Apx 、 Apx 和Apx 。Apx 的毒性最强，表观分子量为 105-110kDa，具有很强的溶血活性和细胞毒性作用，分泌 Apx 的血清型有 1、 5、 9、 10和 11。毒素 型的操纵子包括：毒素激活基因 apx C，毒素结构蛋白基因 apx A，两个分泌基因 apx B和apx D，其中 apx C负责编码毒素激活蛋白，apx A编码毒素结构蛋白， apx B和 apx D与毒素的分泌有关。 apx A基因的 N端疏水区是Apx 的免疫原区， apx A基因的 C端是 Ca2+结合区只对毒素发挥毒性产生作用。Apx 毒素的表观分子量为 103kDa 105 kDa，除血清型 10以外，其他血清型都可以分泌此毒素。 Apx 具有弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞也有细胞毒性作用。Apx 毒素的表观分子量为 120 kDa，是由 2、 3、 4、 6、 8型 APP菌分泌的， Apx 没有溶血活性，但对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。Apx 毒素是新近发现的。研究人员发现任何血清型都能在体内分泌 Apx 毒素蛋白，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。当 apx A与表达载体上的开放阅读框 1（ ORF1）在大肠杆菌中表达时，它有微弱的溶血活性和协同溶血作用（cAMP）。不同 Apx毒素的生物学特性Apx毒素类型 溶血活性 细胞毒性 分子量（ kDa） 分泌的血清型Apx 强 强 105-110 1、 5、 9、 10、 11Apx 弱 中 103-105 除了 10型以外Apx 无 强 120 2、 3、 4、 6、 8Apx 弱 弱 200 所有血清型Apx操纵子基本结构C A B D毒素激活基因 毒素结构蛋白基因 毒素分泌基因胸膜肺炎放线杆菌 apx A基因的克隆与原核表达技术路线：apx A基因的克隆与测序重组表达质粒的构建与鉴定诱导表达诱导表达条件的优化PCR鉴定双酶切鉴定Western Blotting不同时间不同 IPTG浓度不同温度apx A基因的扩增引物设计参照 GenBank中 apx A核酸序列（ D16582），应用 Primer5.0软件设计 1对引物，其上下游引物中分别含有 EcoR 和 Xho 酶切位点，预期扩增长度为 3158bp，由北京三博远志生物技术有限公司合成。上游引物：AGC GAA TTC ATG GCT AAC TCT CAG CTC G下游引物：AGC TCG AGA TCC ATT TGC TCC TCC ATapx A基因的 PCR扩增结果 PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示大小约为 3.2kb，与预期大小一致 。重组质粒 pTA的 PCR和酶切鉴定结果 对重组质粒 pTA进行 PCR和酶切鉴定：PCR扩增出约 3.2kb的目的条带； EcoRI和 XhoI双酶切后切出大小分别为 3.0kb和 3.2kb的两条带，结果表明目的片段已克隆到质粒载体上。 目的片段序列测定 pTA的测序结果与 GenBank中发表的APP标准 10型 apx A基因（ D16582） 进行同源性分析，结果表明，两端的同源性分别为 99.4%和 99.6%。表明 apx A基因已经成功克隆到 pGEM-T easy vector克隆载体 中。重组表达质粒 pETA的 PCR和酶切鉴定结果 对重组质粒 pETA进行 PCR和酶切鉴定： PCR扩增出约 3.2kb的目的条带； EcoRI和 XhoI双酶切后出现5.9kb的空载体和 3.2kb的插入片段两条带。鉴定结果表明目的片段以正确方向插入原核表达载体 pET-32a中。 不同时间诱导表达的SDS-PAGE电泳图含有重组质粒的 BL21（ DE3）经 IPTG诱导后，可表达一相对分子量约 120kDa的融合蛋白，与实际预测大小相符，不同诱导时间显示诱导后 5 6h表达量最高。不同浓度 IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳图 将不同 IPTG浓度诱导的样品进行SDS-PAGE ，结果表明， IPTG浓度为0.6mmol/L的蛋白表达量最高。不同温度 IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳图将不同温度诱导表达的样品进行SDS-PAGE ，结果表明，在 25 条件下表达的蛋白表达量最高。 重组质粒 pETA表达产物 Western blotting检测结果 表达蛋白经 SDS-PAGE电泳后转印至 PVDF膜上，用兔胸膜肺炎放线杆菌免疫血清作一抗，羊抗兔 IgG作二抗进行免疫印迹检测。结果可见一条特异性的抗原抗体结合带，分子量大小与目的蛋白相同，从而证明表达的目的蛋白是 apx A蛋白。裂解后 SDS-PAGE电泳图 超声裂解后进行SDS-PAGE：经超声波裂解后离心，分别对上清和沉淀进行 SDS-PAGE。结果表明，目的蛋白在沉淀物中，故可判定目的蛋白以包涵体形式存在。apx A表达蛋白的免疫原性研究技术路线： 三种表达蛋白的纯化及 Western blotting分析 天然 Apx 毒素蛋白的提取免疫原浓度的测定与免疫小鼠用间接 ELISA方法检测免疫后小鼠的抗体水平APP1型菌和 APP10型菌半数致死量（ LD50）的确定与攻毒三种蛋白纯化后的 SDS-PAGE电泳图 纯化后的蛋白经过 SDS-PAGE，结果如图所示，三种蛋白的大小分别为 120kDa、58kDa、 79kDa。纯化后比较显示杂带减少，表明纯化效果良好。 三种蛋白的 Western blotting 检测结果 用 APP10型菌免疫兔的阳性血清作一抗，用HRP标记的羊抗兔 IgG作二抗，进行 Western blotting分析，结果如图所示，三种蛋白都与阳性血清反应，说明都具有免疫原性。APP10型菌所提取的天然 Apx 经过 SDS-PAGE，如图所示，用饱和硫酸氨（ NH4） 2SO4）沉淀法提取天然 ApxI毒素蛋白的大小为 105 110kDa。免疫原浓度的测定结果经 BCATMProtein Assay Kit测得apx A表达蛋白浓度为 2.5mg/ml、apx AN表达蛋白浓度为 3mg/ml、apx AC表达蛋白浓度为 2.4mg/ml、提纯的天然 Apx 毒素蛋白浓度为 5 mg/ml。实验动物分组组别 小鼠数量第一组：天然 Apx 毒素蛋白免疫组 12只第二组： apx A表达蛋白免疫组 12只第三组： apx AN表达蛋白免疫组 12只第四组： apx AC表达蛋白免疫组 12只第五组：空白对照组 12只免疫程序与剂量将提取的天然 Apx 毒素蛋白和三种表达蛋白乳化后分别免疫小鼠，共免疫三次，每次间隔两周。一免：将纯化的三种表达蛋白与提纯的天然 Apx 毒素用 PBS稀释，与