蛋白质电泳技术

电泳技术段天璇一、基本理论 1. 常用公式和术语oE=U/L 电场强度 (V/cm)=电压 (V)/电极间距 (cm)*相对迁移率 mR=蛋白质迁移距离 /示踪染料迁移距离oep=v/E =l/(tE)=lL/(tU) =q/(6r) (cm2/(s*V) F=qE =F=6rv l： 蛋白质迁移距离o电泳速度 v=epE=epJ/K o分离度影响电泳的环境因素电泳速度 v=epE= E/(C)o C: 6or 4 E pH: pI(4-7), 缓冲溶液 pH(8-9.5), 向？极泳动 离子强度 I: 0.02-0.2 电渗 温度：焦耳热 介质：孔径、制胶重复性等2. 分类 按原理 :o 区带电泳 , (移界电泳 ), 稳态电泳 , 显微电泳3. 电泳仪及附属设备 提供稳定直流电源的装置o电压、电流、电功率稳定o脉冲式 电压 o 常压电泳仪 (600V): 净电荷和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳o 高压电泳仪 (3kV): 载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序o 超高压电泳 (30-50kV): 毛细管电泳 电泳槽o 板状电泳槽 水平板 垂直板o 管状电泳槽*自由界面电泳槽DYCP-33A型 琼脂糖水平电泳仪 (槽 )(中号 ) DYCZ-22B型 单垂直电泳仪 (槽 )（大号） 4.电泳的支持介质 特性（要求）o物理化学性质稳定o化学惰性 o 均匀 种类 分离原理 特性 物 质薄膜 类 电 荷密度 化学惰性对 流 扩 散小纸 、醋酸 纤维 素薄膜、聚 酰 胺薄膜凝胶 类 电 荷密度分子大小同上 +多孔性分子 筛 效 应（淀粉）、 聚丙 烯酰胺凝胶 、 琼 脂糖凝胶、新型凝胶介 质5.检测 -染色方法 考马斯亮蓝 ：常用 荧光染料：灵敏 硝酸银：灵敏 酶活性 免疫学：专一 特殊蛋白质o糖蛋白、脂蛋白、铁蛋白、铜蛋白 三苯基甲烷衍生物， -SO3-蛋白质的碱性基团 染料 -蛋白质复合物。oR型oG型二甲花青亮蓝 -甲基取代的三苯基甲烷衍生物 染色o 固定蛋白质 -染色 -脱色o 同时固定和染色 -脱色o 脱色 30% 甲醇的 10% 乙酸溶液等二、琼脂糖凝胶电泳agarose gel electrophoresis 支持介质：琼脂糖 结构： 1,3连接的 -D半乳糖和 1,4连接的 3,6脱水 -D半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成交联结构 特点：大孔胶，适于核酸、线性 DNA, RNA分离分析 分离原理： 0.2-50kb 操作形式：水平电泳、免疫电泳、平板等电聚焦AgaroseD-galactose 3,6-anhydroL-galactose 性能指标o电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、脱水收缩作用o纯度：硫酸根含量少，纯度高 应用：核酸研究 , 不同浓度凝胶分离 200bp-50kb DNA 检测：荧光染料溴乙啶，电泳后染色 操作过程：o见 Agarose Gel Electrophoresis.ppt三、醋酸纤维素薄膜 cellulose acetate film 纤维素 -乙酰化 特点o定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色o较快速：电渗小o灵敏度高，样品用量少： 5微克蛋白质o薄膜可保存o操作简单快速价廉 应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、脱氢酶、多肽等四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 以 polyacrylamide gel为 分离介质 分离原理：电荷密度 +分子筛 特点 应用领域 操作形式o(圆盘电泳 )o垂直板电泳o水平板电泳1.聚丙烯酰胺凝胶 polyacrylamide gel, PAG 聚合o 化学聚合o 光聚合 总浓度与交联度单体 交联剂 催化剂丙烯酰胺 + N,N-亚甲基双丙烯酰胺 PAGAcr Bis 加速剂过硫铵 (AP)-化学聚合or核黄素 VB12 光聚合N,N,N,N-四甲基乙二胺TEMED反 应 影响因素 产 物特点 应 用浓 度、比例、 pH、 温度、含氧、 杂质 等 孔径 较 小 分离胶光照条件 孔径 较 大 浓缩 胶总浓度与交联度的影响 凝胶浓度 T=(a+b)/m 100% (g/mL) 交联度 C= b/(a+b) 100%oa=mAcr; b=mBis; m=V a/b： 凝胶性状、孔径、分子筛效应等oC=6.5-0.3T 浓度筛选：标准凝 胶 T=7.5% 或梯度胶凝胶孔径CT nm 1 5 15 256.6 2.4 1.9 2.88.0 2.3 1.6 2.4 3.610.0 1.9 1.4 2.0 3.012.0 1.7 915.0 1.4 7蛋白 质相 对 分子量适用凝胶 浓 度蛋白 质相 对 分子量适用凝胶 浓 度50万 2-54-10万 10-152. 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1959) 凝胶孔径、缓冲液（样品、凝胶、电极）不变 分离原理：样品电荷 特点：制胶简单、条件简单恒定、分辨率不高 适用：简单样品3. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 含义：不同胶孔径、不同缓冲液 分离原理：电荷效应 +分子筛效应 特点：样品成分浓缩 -分离，分辨率高；操作复杂 适用：广泛应用的主要电泳技术 3种物理效应o样品浓缩；分子筛效应；电荷效应 不连续性o凝胶浓度：浓缩胶 -分离胶o缓冲液离子成分o缓冲液 pHo电位梯度 制胶分离胶样品胶浓缩胶抽气浓缩胶储液 :2(10%Arc+2.5%Bis)1.0mol/L Tris-HCl缓冲 液 pH6.8:140% 蔗糖 : 4TEMED: 0.0054mg/100mLVB120.001水封静置蒸馏水 : 4.930% 凝胶储液 :2.5(29.1%Arc+0.9Bis%)1.5mol/L Tris-HCl缓冲液 , pH8.9: 2.510%Ap:0.05TEMED: 0.006水封静置抽气25mmol/L Tris+192mmol/LGly缓冲液 pH8.3-+4. SDS-PAGE十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离原理 : 分子筛 -分子相对分子质量o蛋白质 -SDS复合物呈棒状且大量带电 (-),消除样品蛋白质分子间电荷差异 应用： 蛋白质纯度检测和相对分子量测定 操作形式：多用垂直管或垂直板，不连续系统，或梯度胶SDS-PAGE 操作特点o样品 :o制胶：o缓冲液：分离、浓缩胶缓冲液均含 SDSo等 分子量的确定o染色 考马斯亮蓝 -蛋白质吸附量 -近似 Beer定律 其他染色o计算标准蛋白质 mR，作 lgMr-mR标准曲线o待测蛋白 mR - Mr同时测定5. 梯度凝胶电泳 分离胶浓度为线性或指数梯度 分离原理：蛋白质分子大小 T 4-30%, Mr 5万 -200万，分辨较小 Mr差异 可不与 SDS反应，与 SDS-PAGE互补 常加入 SDS 制胶：梯度混合器五、等电聚焦电泳 isoelectric focusing IEF 分离原理：利用 pH梯度的介质分离 pI不同的蛋白质o分辨率 pI相差 0.01-0.001 适用o研究蛋白质微观不均一性o测定蛋白质等电点 操作形式 : 水平平板、 (管式 ) 获得 pH梯度o人工 pH梯度 : 不稳定，可用于制备o自然 pH梯度 载体两性电解质：一系列 pI不同的多氨基多羧基混合物 (合成过程产生连续变化的氨基羧基比