蛋白质综合实验

蛋白质综合实验蛋白质浓度测定介绍 四种古老的经典方法 : 定氮法，双缩尿法（Biuret法）、 Folin酚试剂法（ Lowry法）和紫外吸收法。新的测定法 : 考马斯亮蓝法（ Bradford法）。 还有近来广为应用的蛋白定量方法 BCA 法。在选择方法时应考虑 实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质； 溶液中存在的干扰物质； 测定所要花费的时间。紫外吸收法 较为灵敏； 快速； 5 10分钟； 原理：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 . 干扰物质：各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 说明：用于层析柱流出液的检测；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用 .BCA（ 2,2-联喹啉 -4,4-二甲酸二钠）法原理： 在碱性环境下蛋白质与 Cu2+络合并将Cu2+还原成 Cu1+。两分子的 BCA(在 BCA反应液中）螯合一个 Cu1+ ，形成 紫色 的反应复合物。该水溶性的复合物在 562nm处显示强烈的吸光性。优点：灵敏度非常高 ; 较快速 40分钟内；干扰物质：螯合剂；略高浓度的还原剂 说明：抗干扰能力强， 蛋白不可逆的变性蛋白质含量的测定（ Lowry法）实验目的1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理2.掌握 Folin-酚法（ Lowry法）测定蛋白质浓度的操作技术 原理蛋白质含有两个以上的肽键 (CONH) ， 因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与 Cu2+形成 紫红色 络合物。 Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进 Folin试剂 (磷钼酸 磷钨酸试剂 )，蛋白质 铜络合物能还原磷钼酸 磷钨酸试剂，生成 蓝色 物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏 1020 倍，较双缩脲法灵敏 100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 操作方法血清蛋白的测定和标准曲线制作试管编号 1 2 3 4 5 6 7标准蛋白 (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 稀释血清 (mL) 1.00.9 NaCl(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 碱性铜溶液 (mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀后室温放置 20 min。酚试剂 (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 摇匀， 30min后以 0号试管为空白对照，在 650nm处比色 .作图 以 OD650为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制一条过原点的标准曲线。求算标本血清中的蛋白质浓度 查图：利用测定管读数在标准曲线上查出蛋白量（ X），最后如下算出标本的蛋白含量：g X*（ 100/0.002） *10-6 以标准管和测定管的吸光数，按下列公式计算：g（ OD测定 /OD标准 *标准管蛋白量） *（ 100/0.002）注意事项1）加入酚试剂时动作要快并立即摇匀，不应出现混浊2）标准曲线制备： 至少要有五个点以上。一条理想的标准曲线应该是斜率接近 l，且通过原点的直线，其范围应在被测物浓度的一半到二倍之间。吸光度在 0.05 0.8之间。如果待测样品浓度超过标准曲线浓度范围，应将样品稀释再测。临床意义总蛋白增加：血液浓缩（严重腹泻、呕吐、高热、休克）；合成增多（多发性骨髓瘤 G）总蛋白减少：血液稀释（补水过多、水钠潴留）各种原因所至的白蛋白减少，如：合成不足（肝脏功能下降）合成原料不足（饥饿、腹泻、消化道肿瘤）去路增多 (肾病综合症、大量胸腹水、烧伤、大出血 )消耗过多（糖尿病、甲亢、肿瘤等）层析法实验目的1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。2学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。层析基本知识层析定义层析法又称色谱法，利用分离物质中不同组份的 某些理化性质 的差异而建立起来的一种分离技术由 固定相 和 流动相 组成层析分类根据操作形式不同分类根据分离机制不同分类凝胶层析凝胶是一种具有多孔，网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小，形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；大小分子分开：大分子行程较短 ,已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。 l分辨率不高，分离操作较慢。分子量的差异仅表现在流速的差异上，分离时流速必须严格把握。l对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。l凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。 常用的常用的 凝胶类型 有有 :交联葡聚糖 (sephadex)交联琼脂糖 (sepharose CL)聚丙烯酰胺凝胶 (biogel P)琼脂糖 (biogel A)多孔玻璃 (bio glass)聚苯乙烯 (bio-beads)等。 Spandex G(10-200) （ 1） 数大，交联度小，网孔大数大，交联度小，网孔大（ 2）代表持水量，）代表持水量， G-25， 1g干胶持水干胶持水 2.5ml.操作： 装柱 加样 洗脱 清洗 凝胶回收做思考题实验结果一、描述实验现象二、分析实验现象聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）分离血清蛋白1了解凝胶电泳的基本原理及其主要影响因素。2掌握凝胶电泳分离血清蛋白的方法。实验目的实验原理以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是聚丙烯酰胺和 N,N-甲叉双丙烯酰胺交联而成的，催化剂为过硫酸铵，加速剂为 TEMED（四甲基乙二胺 ） 。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶不连续体系与非解离体系，电泳迁移率的大小与带电粒子的大小、形状和带净电荷的数量等因素有关。电荷数和分子大小不一的各种血清蛋白质通过 浓缩效应 、 电荷效应 、 分子筛效应 而被精细地分离。由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成 5 7个组分，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分出 12 30个组分。 实验仪器1垂直板电泳糟2直流稳压电源3微量移液器4脱色摇床实验试剂与材料1分离胶缓冲液 (4X) ： 1.5M Tris一 HCl pH8.8， 100ml2浓缩胶缓冲液 (4X) ： 0.5M Tris一 HCl PH6.7， 100ml3胶母液 (T34%， C6%) ：称取丙烯酰胺 29.2g， 亚甲双丙烯酰胺 0.8g，水溶至 100ml，不能加热。4 10%过硫酸铵 (AP) ：用少量煮过 10分钟并冷却的蒸馏水配制，在 4 可存 3-4周，100ml。 5电极缓冲液 (l0X) ：称 Tris l5.lg，甘氨酸 72g溶于水中，定容至 500ml，使用前 1:9稀释（或者再稀释 2-5倍也可）。6样品染色液（ 考马斯亮兰染色液） ： 0.09%考马斯亮兰 R一 250， 454ml 50%甲醇，46ml冰乙酸定容到 5O0ml。7加样缓冲液：甘油 3.2m1， 2M Tris一 HCl（ pH6.8） 1.25ml，溴酚兰粉末少许加水至l0ml。8脱色液： 20%甲醇， 7% 10%的冰乙酸 (现用现配 )9凝胶配制：实验用分离胶为 10%，浓缩胶为 3%（现用现配）(一 )凝胶的制备(二 )加样(三 )电泳(四 )剥胶(五 )染色(六 )脱色基本实验步骤实验步骤 1.胶模固定：将两块洗净的玻璃板，按要求对齐，夹好。 将胶模装入电泳槽固定好 ，并将胶模下端封好，防漏。 (电泳槽按要求清洗干净 )。2.制备分离胶：按分离胶配制方法配好分离胶，缓慢注入胶模中（占玻璃板的 2/3），为了防止氧化，沿玻璃板壁轻轻加一层水层（注意不能将胶冲起），室温下聚合 40min。3. 制备浓缩胶：配制好 4%浓缩胶。将胶模中上层水倾倒出去，用滤纸吸干余水。倒入浓缩胶插好样品梳，注意避免汽泡出现，室温下聚合 20min。4. 将胶模装好，去胶条后，装入电泳槽中 ，检查是否漏液后，倒入电泳缓冲液，胶模内侧的液面没过矮板但不可超过高板（矮板在内）。5. 上样：将样品梳拔出，用电极缓冲液冲洗样品孔。样品与样品缓冲液按一定比例混合好（蛋白含量大约为 1- 2g/l）。 电泳 :连接直流稳压电源，矮板连负极，打开电源开关。 染色 : 关闭电源，取下凝胶模