镜检技术幻灯片1

疟原虫的镜检技术血涂片制作与染色荣成市疾病预防控制中心E-mail: 主讲内容： 厚薄血膜的制作与染色。 疟原虫计数方法。 疟原虫人体内生活史简介。 相关注意事项小结。疟疾的疟疾的 实验室 诊断诊断1.病原学诊断：显微镜血涂片检查结果阳性； 这种镜检确诊最可靠。2.免疫学诊断：（ 1）循环抗原的检测 （ 2）循环抗体的检测3.分子生物学技术： PCR和 DNA探针已应用与疟疾的诊断。 分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟疾的 “金标准 ” 仍然是病原学诊断显微镜检查疟原虫。 快速诊断试纸条可与镜检疟原虫相互补充。 血膜的制作（取血时间） 采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 疟疾典型的临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发热期、出汗期和间歇期五期。 间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。 发热期， 外周血中以 环状体（小滋养体）为主， 也可见到裂殖体； 出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。发作后数小时（ h），间歇期外周血中以 大滋养体 为主，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发作 36-48h，可检出裂殖体；发作 1-2次后， 配子体 出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至 20h内取血，初发患者退热后常查不到原虫。末梢血 血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状体之后的 10天左右。血膜的制作 （取血操作）在采集标本、制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址。 采血部位和方法： 采血部位一般人为耳垂，指头；一人一针，常规消毒、采血。 取血部位和血量采血部位 和 取血方法 ： 耳垂或无名指（婴幼儿母趾或足跟）， 通常在耳垂取血 ， 先用 75%酒精棉球消毒取血部位 ， 待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方 或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤， 不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。 厚血膜血量约一粒大米（即火柴头）大小。采血详细部位、取血方法有小技巧。血膜的制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称 薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称 厚血膜 。无特殊要求的可厚薄血膜分载玻片涂制。发热病人血片 标本片血膜的制作 （涂片操作） 涂制厚、薄血膜的位置 通常将厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载片分为 6等分，第 1、 2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第 3格中央，薄血膜涂在第 4格前缘至 第 6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各 1个； 门诊和发热病人血片每片 1人， 涂 2个厚血膜 1个薄血膜，以防血膜脱落而影响检查；标本片发热病人血片标签薄血膜的制作 薄血膜 用推片一端边缘的中点从取血部分 取约1 1.5微升的血量（相当于 1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触， 并形成 25 350夹角，待血液向两侧扩展约 2cm 2.5cm宽时 ，均匀而迅速地从右向左推成舌状薄血膜（约 2.5cm长）。推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。 薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕， 位于玻片 1/21/3处 【 左半部分（或第 46份） 】 。熟练工作者的推片姿势厚血膜的制作 厚血膜 用推片的左下角，从取血部位刮取 约 4 5微升血量（相当于火柴头大小）， 使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转 2 4圈，涂成 直径 0.8 1cm大小圆形厚血膜 (厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到 5 10个自细胞为宜 )， 厚血膜的位置，位于玻片右 1/3处 中央偏右（或 6等份中的与贴标签的 1、 2份相邻的第 3份中部） 。 厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。 过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求，以油镜视野 5-10个 WBC为宜。标准的疟疾厚薄血膜位置各种不同的疟疾血片涂制法：标准血片 （ 1人）门诊发热病人血片 （ 1人）居民普查血片 （ 2人）血膜的制作血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码，以防差错；待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。染液的种类染液种类：疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是 瑞氏（ Wright stain）和吉氏染液（ Giemsa stain）。 这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称 多色性染剂 。我们主要用吉氏染液，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊量大的门诊实验室使用。染液的染色原理染色原理是染料于被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学反应。红、白细胞和疟原虫所含蛋白质的氨基酸电离出的阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所带的阴阳离子相互结合便被染上不同的颜色。疟原虫和白细胞的胞浆被染成蓝色， 红细胞、疟原虫和白细胞核被染成紫红色。红、白细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带正电荷的 -NH3+和一个带负电荷的 -COO-。多色染剂的 碱性染料美蓝 的有色基团带阳离子，可与细胞中带负电荷的 -COO-部分结合，使之成为 蓝色 。疟原虫 、淋巴和大单核细胞 的胞浆 、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质，故 被染成蓝色 。 酸性染料伊红 的有色基团带阴离子，可 与 细胞中带正电荷的 -NH2+部分结合，使之呈 红色 ；但 美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞的核着色，可美蓝氧化后产生的天青有媒染作用， 于是，在媒染物与染料的共同作用下， 疟原虫 和白细胞 核 被染成 紫红色 。染液的种类及染色原理注意 ： 蛋白质和氨基酸都是两 性 电解质，要求 染液的 pH值 7.0-7.2较好。染液偏酸 时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使 红细胞和疟原虫的核染成鲜红色 ，而 淋巴细胞和原虫的胞浆着色较差 ；反之，当 染液偏碱 时， 红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色 ，不易观察。姬氏染液母液配置方法取姬氏粉 0.5克 置于研钵中，加 25ml甘油 充分研磨，倒入 60或100ml带有玻塞的 有色 玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至 25ml甲醇 洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于 5560 水浴中或温箱内 24h或室温内 35 天，多加摇动，即成原液。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。材料： 1、姬氏粉 0.5克 2、甘油 25ml 3、 甲醇 25ml注意事项：1.高纯度试剂。2.所用器皿绝对无水（伊红在水溶液内遇到美蓝或天青即可互相化合而产生沉淀，从而失去染色力）。3.边加边磨， 充分研磨； 整个染色液配制时间不能少于 5个小时。 姬氏染液的染色方法先用甲醇或无水酒精固定薄血膜 ,再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后再进行染色。注意： 吸取母液时，不要晃动瓶子 ,以免沉淀物泛起影响染色效果 .成批血片染色 ： 将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入 3%吉氏染液稀释液（ 3毫升吉氏原液加缓冲液或净水 97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色 30min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。单张血片染色 ：将处理好的血膜，加姬氏母液 1-2滴 ，加中性蒸馏水 15-30滴 ，染色 30分钟左右，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。较理想的染色结果是 红细胞为淡红或淡紫红色 ， 疟原虫的胞质呈蓝色 ， 核为紫红色 ， 疟色素为棕褐色 。操作 1 （快染） 配制 5%染液，（每张血片约需染液 2ml） ： 量筒内量 2ml缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加吉氏原液 7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色 10min， 清水细缓冲洗，晾干镜检。 （一般配制 5%-10%，染色时间短，一定掌握好时间。）操作 2 (慢染 )配制 3%染液： 在染色量筒内量 2ml蒸馏水或 新鲜凉开 水， 再滴加 吉氏原液 4滴，混匀， 滴入待染标本上， 染色 3040min。 清水细缓冲洗， 晾干镜检。 （一般配制 2.5%-3%染液， 染色效果稳定。）吉氏染液浓度门诊染色全国疟疾镜检知识与技能竞赛的竞赛内容及 分值比例1.理论知识竞赛内容为：疟疾病原和诊断基本知识。包括：疟原虫生史，血片制作、染色、镜检操作理论，显微镜使用与维护知识。2.技能竞赛内容为：制片染色和镜检读片。包括：厚、薄血片的制作和染色；疟原虫的显微镜镜检，确定阴阳性和虫种，定量计数以及显微镜的使用与维护。3.分值比例：每位选手满分 100分，其中理论竞赛 20分，技能竞赛 80分；技能竞赛中，制片染色 15分， 镜检读片 60分， 显微镜使用与维护 5分。将来咱们省内竞赛内容及分值比例参考该标准。本次培训测试降低难度。全国疟疾镜检知识与技能竞赛血片制作和染色质量评价标准 好血片制作质量 : 厚血膜： 血量 4.0 5.0ul,位置 玻片右 1 3稍偏右 ,直径 0.8 1.0cm， 外观 圆形厚薄均匀。 薄血膜： 血量 1.5 2.0 ul， 位置 玻片 1 2 1 3处 ， 外观 舌状厚薄均匀 ；染色质量 外观兰紫色； 清洁度 外观光洁无油灰 。 讲义 43页倒数第二行厚血膜用血量 10ul-20ul错误，应更正为 4.0-5.0ul。影响染色效果的因素（ 1）染剂、溶剂的质量（ 2）染液的新旧（ 3）染液稀释后使用时间（ 4）染液的稀释浓度（ 5）染色时间（ 6）染色用水（ 7）冲洗方法 如何确定疟原虫血片为阴性 检查全部厚血膜未查见疟原虫。 最少检查 100个厚血膜油镜视野未查见疟原虫。镜检时间最少不低于 20分钟。借助疟原虫生活史简图，复习一下红内各期原虫形态生 活 史 含成熟疟原虫子孢子按蚊 叮咬人 子孢子随唾液进入人体血液 约 30分钟 侵入肝细胞 裂体增殖 成熟裂殖体（含数以万计裂殖子） 肝细胞破裂 裂殖子侵入红细胞（开始 红细胞内期 发育） 发育 小滋养体（环状体） 摄食营养、发育 大滋养体 核分裂、发育 未成熟裂殖体 核进一步分裂 裂殖体（成熟） 被寄生红细胞破裂 裂殖子释放入血流一部分被巨噬细胞吞噬。 一部分再侵入红细胞，开始新的一轮发育。一部分裂殖子在红细胞内不再进行裂体增殖，而发育成雌，雄配子体。在蚊体内进行有性生殖。由生活史容易看出， 疟原虫对人体的主要致病阶段是红 细胞内期的裂体增殖期； 主要是指红细胞内期的无性体 小 滋养体到成熟裂殖体，而不是红细胞内期的无性体 配子体；可 具有流行病学意义的疟疾传染源为 外周血内有配子体的现症病人和带虫者 ，可见早期诊断治疗的重要性。复发由肝内期 迟发型子孢子引起。 人类四种疟原虫的基本特征感染人的疟原虫有四种 :恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale