《红腺忍冬组培快繁技术规程》征求意见稿编制说明

1 广西地方标准 红腺忍冬组培快繁技术规程  （征求意见稿）编制说明  一、 工作简况  （一）任务来源  本标准是广西壮族自治区质量技术监督局下达的 2016 年 第 六 批广西地方标 准制定（修订）项目计划 （桂质监函 2016 324 号文） ，项目编号为  2016由广西壮族自治区卫生和计划生育委员会提出，广西卫生标准化技术委员会归口，广西壮族自治区药用植物园 负责 起草。  （二）参与起草单位  广西壮族自治区药用植物园 。  （三）主要起草人员名单及职务或职称  二、编制标准意义  红腺忍冬（ ，是中国药典山银花的来源植物之一，具有清热解毒、疏散风热的功效，用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒，热毒血痢，风热感冒，温热发病。红腺忍冬为广西地理标志性物 种，开发潜力巨大，其主根粗壮， 毛细根研  制  人  员  姓名  职务 /职称  现从事专业  所在单位  项   目  负责人  师凤华  副研究员  生物技术  广西药用植物园  主  要  参  加  人  员  谭木秀  研究 实习 员  生物技术  广西药用植物园  蒲祖宁  主任技师  种质资源保存  广西药用植物园  郭晓云  副研究员  生物技术  广西药用植物园  李翠  助理研究员  生理生化  广西药用植物园   2 密如蛛网，枝条多，萌蘖能力强，具有良好的蓄水保土效益，对 喀斯特地貌的恢复具有重要意义。  但近年来红腺忍冬野生资源数量迅速减少，难以满足需求，需加快发展人工种植。而种子繁殖和枝条扦插成活率均不高，因此有必要通过建立起完整、高效、实用的红腺忍冬组培快繁技术体系，加快繁殖速度，提高繁殖系数，为推广红腺忍冬组织培养苗优良种质大面积生产提供技术参考。  经查阅中华人民共和国国家标准批准发布公告、中华人民共和国行业标准备案公告和中华人民共和国地方标准备案公告， 红腺忍冬组培快 繁技术 尚无国家标准、行业标准或地方标准，因此，特进行 红腺忍冬组培快繁 技术研究并据此制定 红腺忍冬组培快繁技术 规程。  三、标准编制起草及研究过程  （一）前期 准备 工作  2012 年至 2015 年，在广西壮族自治区科技厅课题 “ 金银花木犀草苷生物合成相关基因克隆和转化山银花的研究 ”  （项目任务书编号： 2012资助下，完成了山银花的生态环境条件调查，开展了金银花黄酮类生物合成途径关键酶 和黄酮类化合物合成的影响研究、遗传转化体系研究等，在此基础上，标准编制小组成员至今已完成 山银花红 腺忍冬种子发芽条件、 种子实生苗灭菌方法、培养基组分、激素水平、培养条件 、 不同组织芽诱导、 增殖继代、芽诱导及 生根壮苗 等较优的初代诱导技术方案等研究工作，基本掌握红腺忍冬组培快繁技术，在核心期刊上发表相关文章1 篇： 红腺忍冬种子沙培萌发条件和种子沙培苗灭菌方法的初步研究 J2015,38(5):899已申请相关专利 3 项：红腺忍冬无菌组培苗叶柄愈伤组织不定根诱导的方法（  （ 2016 年 4 月 29 日已发受权通知书）、一种华南忍冬叶片不定芽的诱导方法（ （已进入答辩阶段），红腺忍冬无菌组培苗叶柄不定芽诱导的方法（ 2015122400745570已受理；为本标准的 制定实施奠 定了良好基础。  （二 ）标准 编制起草 进度  1、 2016 年 1 月，收到广西壮族自治区质量技术监督局为贯彻落实广西壮族自治区人民政府关于印发深化标准工作改革实施方案的通知（桂政发 201551 号）精神而下达关于征集 2016 年广西地方标准计划项目的通知。   3 2、 2016 年 3 月，广西壮族自治区药用植物园向广西壮族自治区质量技术监督局递交了制定广西地方标准红腺忍冬组培快繁技术 规程的建议书和申请书。  3、 2016 年 5 月，广西壮族自治区药用植物园成立了以师凤华为组长，谭木秀、蒲祖宁、郭晓云、李翠等 5 人组成的标准起草工作小组，该小组在前期研究工作的基础上，对 红腺忍冬组培快繁 关键技术进行了系统总结和集成，同时查阅了大量的国内外文献资料，确定了广西地方标准红腺忍冬组培快繁技术规程的主要技术核心内容，形成了标准的基本构架。  4、 2016 年 6 月，经过标准起草工作小组的充分讨论及多次修改完善，最终完成了广西地方标准红腺忍冬组培快繁技术规程（征求意见稿）。  （三 ）标准研究过程  标准编制 小组成员多年从事 遗传转化及组培快繁 工作并熟练掌握其 技术， 成功 申请到 红腺忍冬 相关项目并 做出一定的成绩 ， 经 前期试验 已 成功 诱导 出 红腺忍冬无菌 组培苗， 具备 一定的 工作基础。 标准编制项目下达后，按照广西区质监局关于编制标准工作的要求， 标准 编制小组 依照标准主题、要求对材料进行整理、收集和调研。 根据各 人研究方向进行分工 合作 ，开展 红腺忍冬 资源的调查和采集 ， 针对试验中出现的 红腺忍冬带腋芽茎段诱导无菌组培苗 难，及此初代诱导苗不易进行继代 培养 、 组培苗繁殖系数低、易褐化、 易 死亡等问题 ， 在 不断 试验的同时咨询了 相关 同行专家，反复 思考总结 、多方位 进行试验筛选 ，确保标准 数据 准确 可靠性。  标准研究的试验材料 来 自广西 马山 县 弄拉 景区的 红腺忍冬成熟浆果 ， 拨取其中成熟饱满的种子进行种子发芽试验，获取种子实生苗，对 此实生苗进行外植体灭菌处理获得无菌组培苗，进一步 进行 相关 筛选 试验获 得 不同组织 外植体 芽诱导、增殖 继代 及生根 壮苗 的较佳试验方案 ，建立 起 红腺忍冬 组培苗快速繁殖技术体系。  四、标准编制原则、依据  （一）制定本标准的目的是 规范 红腺忍冬 组培苗 组培快繁 技术、 拓宽组培苗诱导来源、 提高 组培苗 繁殖系数 质量 ， 实现 红腺忍冬 组培苗 组培快繁 标准化。  （二）本标准的格式和编 写方法执行  规定。  （三）本标准的制定力求科学、准确、系统，内容与当前广西 红腺忍冬组培快繁 的实际和社会经济状况紧密结合，可操作性强。  （四）本标准规定了 红腺忍冬 组培 快繁的术语和定义、取材与处理、 外植体不定 芽 4 诱导 、 继代 增殖、生根壮苗、培养条件、信息记录 。适用于组培苗生产公司和企业通过组织培养技术规范化生产 红腺忍冬无菌 组培苗。  （五）本标准的编写以 广西壮族自治区科技厅课题 “ 金银花木犀草苷生物合成相关基因克隆和转化山银花的研究 ”  （项目任务书编号： 2012为研 究基础， 红腺忍冬 组 织 培 养技术相关 试验 数据为基本 参考 依据 进行 编制 。  五、标准主要技术内容 的确定  （一）范围  本标准规定了红腺忍冬（ 组培快繁的 术语和定义、取材与处理、外植体不定芽诱导、继代增殖、生根壮苗、培养条件、信息记录。  （二）规范性引用文件  下列文件对于本文件的应用必不可少。凡是注明日期的引用文献，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注明日期的引用文件，以其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。  无  （三）主要技术内容  1、材料与方法  材料 ： 广西 马山县 中国 弄拉景区的红腺忍冬成熟浆果 。  方法：  （ 1）不同处理方式对红腺忍冬种子发芽的影响  将当年 10 月底 11 月初采 集 的成熟浆果 一半直接将种子剥出进行播种，另一半浆果经 4 低温贮藏 5 d 后 将 种子 剥出 ，经发芽处理后进行播种，播种后均覆盖一层 0.3 0 目筛的细河砂。种子的发芽处理如下：不浸泡 ， 清水浸泡 24 h， 自来水流水冲洗 24 h， 200  泡 24 h， 400  泡 24 h。 每一处理设 3 次重复，每一重复播种 50 粒种子， 每 天观察并统计各处理种子发芽等相关情况。  种子发 芽能力指标 统计：萌发 以胚轴突破种皮为准，此时即为初次计数时间。自发芽开始之日起，每 天记录萌发的正常幼苗数，挑出霉变种子，至无新萌发种子的天数为末次计数时间。以萌发启动时间、萌发结束时间、萌芽持续时间、发芽率、发芽势作为种子萌发试验评价指标，具体算法如下：  萌发启动时间：从播 种之日起至开始萌发之日所经历的天数。   5 萌发结束时间：从播 种之日起，经过萌发期，至无新萌发种子 时 所经历的天数。  萌芽持续天数：从种子开始萌发之日起，至萌发结束之日，之间所经历的天数。  发芽率（ =（ n/N） 100%（ n 为最终发芽数， N 为供试种子数）。  发芽势（ =（ ） 100%（  i 天种子发芽达到高峰时正常发芽的种子数，N 为供试种子数）。  （ 2）种子 实生 苗消毒灭菌处理  具 3 片以上真叶的种子实生苗 经过消毒灭菌 处理 后转接入培养基 1/2糖 30 g/L+琼脂 6g/L +（ ） 中培养 。 消毒灭菌 设 6 个处理，每一处理 设 3 次重复，每一重复 接种 3 瓶，每瓶接种 2 株 ， 7d 后统计污染率和成活率等相关数据。 处理见表 1。  表 1  不同灭菌方法对红腺忍冬种子实生 苗灭菌效果的影响  前处理方式  灭菌剂种类及 灭菌时间  75%酒精 (S)+苗原培养条件  灭菌方式  于超净台上直接用无菌水冲洗  0+ 0 密闭培养瓶中  连根整株取出，不灭菌，连根转接  30+ 5 密闭培养瓶中  连根整株取出，仅对下胚轴以下部分进行灭菌，连根转接  30+ 5 密闭培养瓶中  连根整株取出，整株全部灭菌，连根转接  30+ 5 密闭培养瓶中  弃根，整体灭菌，整体转接  洗洁精水刷洗 30+5 密闭培养瓶中  弃根，整体灭菌，整体转接  30+ 5 开放花盆中  弃根，整体灭菌，整体转接  （ 3） 不同种类细胞分裂素对红腺忍冬不同部位愈伤组织诱导及成芽的影响  以苗龄为 40 生长健壮的 无菌 组培 生根苗的叶片、叶柄及 无芽 茎段三部位 为材料， 以 糖 30g/L+琼脂 6g/L+ 为基本培养基，分别添加 、 、 ， 共 12 个处理，每一处理 设 3 次重复，每一重复 接种 3 瓶，每瓶接种 8 个外植体，每周观察一次 ， 于接种后起第 30 天、 60 天及 90天统计相关数据。  （ 4） 继代 增殖培养  试验一：不同浓度 6红腺忍冬芽增殖 继代及节间伸长的影响  以苗龄为 40 生长健壮的 无菌组培 生根 苗芽为材料， 以 糖 30g/L+琼脂6g/L+ 为基本培养基，分别添加  60、 ， 6 另设 糖 30g/L+琼脂 6g/L+ 6 + 为平行对照 ； 每一处理 设 3 次重复，每一重复 接种 3 瓶，每瓶接种 2 株芽苗 ， 于接种后 第 30 天、 60 天及 90 天统计相关数据。  试 验二 ：不同浓度 红腺忍冬无菌苗继代增殖及节间伸长的影响  以苗龄为 40 生长健壮的 无菌组培 生根 苗芽为 材料， 以 糖 30g/L+琼脂6g/L+6  为基本培养基，分别添加 0、 ，共 9 个处理 ， 每一处理 设 3 次重复，每一重复 接种 3 瓶，每瓶接种 2 株芽苗 ， 于接种后 第 30 天、 60 天及 90 天统计相关数据。  （ 5）不同种类生长素对不同来源材料的红腺忍冬生根壮苗的影响  以苗龄为 40 生长健壮的 无菌组培 生根 苗芽为 材料， 以 1/2糖 30g/L +琼脂 6g/L 为基本培养基，分别添加 、 、 ， 未 添加生长素的组合为对照，同时以从带腋芽茎段为外植体诱导出的初代无菌诱导苗接入 处理为平行对照， 共 5 个处理， 每一处理 设 3 次重复，每一重复 接种 3 瓶，每瓶接种 2株芽苗 ， 于接种第 30d 及第 60d 时统计相关数据。  2、结果与分析  （ 1）不同处理方式对红腺忍冬种子发芽的影响  由 下表 2 可 知 ， 不同处理方对红腺忍冬种子的萌发启动时间、萌发结束时间、发芽持续时间、发芽率及发芽势的影响程度均不同。 低温处理的种子平均发 芽率及平均发芽势优于未经低温 的 处理， 并且 种子发芽持续时间 缩短 ； 溶液浸 泡的处理 种子发芽率与发芽势均高于其它处理，发芽持续时间缩短明显 ， 以处理 00 浸泡的平均发芽率和平均发芽势最 高， 发芽早，发芽持续时间短 ； 是否经过 清水浸泡或流水冲洗对种子平均发芽率的影响不大 ，但 流水冲洗 能缩短 种子发芽持续时间 。 综合可知，以溶液 对 经 4 低温 储藏 5 子 浸泡 24 子发芽 的较佳 处理 。  表 2  不同处理方式对红腺忍冬种子发芽 的影响  处理方式  萌发启动时间  / d 萌发结束时 间  / d 发芽持续时间  / d 平均发芽率  / % 平均发芽势  / % 未经 4 储藏  不浸泡   4 低 温 储 不浸泡  7 藏 5d 自来水流水冲洗 24h  浸泡 24h 00 浸泡 24h 00 浸泡 24h  2）不同灭菌方法对红腺忍冬种子实生苗灭菌效果的影响  由 下 表 3 可知， 6 个处理的种子 实生 苗成活率均为 100%，但不同灭菌方式对红腺忍冬种子沙培 实生 苗灭菌效果差异显著： 经 洗洁精水刷洗 ；弃根转接的效果优于连根转接， 经 开放式沙基培养 的实生苗外植体转接的平均污染率和苗生长状况均 优于封闭式的沙基培养。 由此可 知 ，对开放沙基培养的 实生 种子 苗下胚轴以上部分用洗洁精水刷洗 冲洗之后进行 75%酒精 (30 S)+ 菌处理的灭菌效果最好。  表 3  不同灭菌方法对红腺忍冬种子沙培苗灭菌效果的影响  清洁 方式  灭菌及转接 方式  平均污染率  / % 平均成活率  / % 苗生长状况  于超净台上直接用无菌水冲洗  连根整株取出，不灭菌，连根转接   连根整株取出，仅对下胚轴以下部分进行灭菌，连根转接   连根整株取出，整株全部灭菌，连根转接   弃根，整体灭菌，整体转接  + 洗洁精水刷洗 弃根，整体灭菌，整体转接  + 弃根，整体灭菌，整体转接  + 注：同列不同小写字母表示有显著性差异， P 列不同大写字母表示有极显著性差异，P -：差； +：好； +：较好； +：最好  （ 3） 不同种类细胞分裂素对红腺忍冬 不同部位愈伤组织 诱导及 成芽的影响  据下表 4 可知， 愈伤组织诱导效果： 、 、 、 4 种细胞分裂素中均可将 红腺忍冬叶片、叶柄及无腋芽茎段 3 种外植体 诱导出愈伤组织 ； 在细胞分裂素 、  及  3 个处理中 ， 3种外植体 愈伤组织 诱导率 均 为：无腋芽茎段叶柄 叶片 ， 在 L 处理 ：叶片无腋芽茎段 叶柄 ； 就同一部位 不同细胞分裂素 而言 ， 各 部位 愈伤组织诱导率高低为 8 （以 3 次统计的平均数 为依据 ） ：叶片： 柄和无腋芽茎段均为：  愈伤 组织 不定芽诱导 效果： 除 ，其它 3 种细胞分裂素  能诱导出不定芽。 3 种细胞分裂素对 3 部位不定芽诱导率高低及芽质量效果均为：  及  2 个处理 均能将 这 3 种外植体 诱导出不定芽 ， 且这 3 部位诱导率大小 及芽质量 高低 均为无腋芽茎段叶柄叶片 ； 3 部位 在各 时期 芽诱导率均 表现 为  处理只能将叶片和无腋芽茎段 导出不定芽 ， 其中叶片 的芽 诱导率 较高 。  另外， 叶片、叶柄及不带芽茎段 3 部位在 4 种培养基中诱导出的愈组均为颗粒状、质地硬、无水渍；愈伤组织颜色变化趋势均随着培养时间递增而呈米白色 深绿色 褐化现象。  综合可 见 ， 愈伤组织诱导效果：优选组合为：无腋芽茎段在培养基 糖 30g/L+琼脂 6g/L+  中的 愈伤组织 诱导效果最佳 ，培养至第 30d 时，诱导率高达 培养至第 90d 时，愈伤组织直径达 不定芽诱导效果：以无 腋芽 茎段 在培养基 糖 30g/L+琼脂 6g/L+ 中的 不定芽诱导 效果最佳 ，培养至第 60d 时，平均芽数达 质量最佳 ， 培养至第 90d 时， 不定芽诱导率 可 达   表 4  不同种类细胞分裂素对红腺忍冬不同部位愈伤组织诱导及成芽的影响  培养基种类及浓度（ ）  接种部位及接种量（个）  培养天数（ d）  出愈率（ %）  成活率（ %）  愈组大小(芽诱导率（ %）  总芽数（个）  平均芽数  芽质量   片  30   60  90  叶柄  30   60  90 + 无腋芽茎段  30   60 + 90 + 片  30   60 +  9 90 + 叶柄  30   60 + 90 + 无腋芽茎段  30   60 + 90 + 片  30   60   90   叶柄  30   60   90   无腋芽茎段  30   60   90    片  30   60  90  叶柄  30   60   90   无腋芽茎段  30   60 + 90 + 注：平均芽数 =芽总数（个） /出芽的外植体总数（个） ；芽质量： +：一般， +：较好， +：最佳  （ 4）继代增殖培养  试验一：不同浓度 6红腺忍冬芽增殖继代及节间伸长的影响  据下表 5 可知， 同一处理中，随着 培养 时间的增加，芽增殖倍数、芽平均高度、芽节间长度及芽平均叶片数均呈逐渐上升趋势， 接种后第 30d、 60d、和 90d 这 3 个时间点的统计数据显示， 芽增殖倍数均以处理 + 6  最高，分别为： 及 ；对 芽平均高度、芽节间平均长度及芽平均叶片数诱导较好的处理为 + 6  及 + 6 ， 6  的处 10 理 芽健壮度最佳；  的 芽增殖诱导及芽高度有明显的促进作用。 表 5  不同浓度 6红腺忍冬芽增殖继代及节间伸长的影响  ) 6) 培养时间（ d）  芽增殖倍数（ t）  芽平均高度 (芽节间平均长度（  芽平均叶片数 (p) 颜色  健壮度   30 绿  + 60   + 90 绿  + 0 1 40 绿  + 60   + 90   + 0 绿  + 60 绿  + 90   + 0 绿  + 60 绿  + 90 绿  + 0 绿  + 60 绿  + 90   + 0 绿  + 60 绿  + 90   + 0 绿  + 60 ,00 绿  + 90   + 0 绿  + 60 绿  + 90   + 注： +：一般， +：较好， +：最好  实验二：不同浓度  红腺忍冬无菌苗继代增殖及节间伸长的影响  由下表 6 可见， 在  范围内， 随着 度的升高，红腺忍冬芽增殖倍数呈上升趋势， 处理 + 的芽增殖倍数最高，为 1 倍（ 30d）、 （ 60d）、 （ 90d）。 同浓度对红腺忍冬节间平均长度和芽平均叶片数 的影响不大。  表 6  不同浓度 红腺忍冬无菌苗继代增殖及节间伸长的影响  ) 培养时间（ d）  芽增殖倍数（ t）  芽平均高度 (芽节间平均长度（  芽平均叶片数 (p) 颜色  健壮度  （  30 绿  + 60   + 90 绿  + 0 绿  + 60   + 90 绿  + 0 绿  + 60   + 90 绿  + 0 绿  + 60   + 90 绿  + 0 绿  + 60   + 90 绿  + 0 绿  + 60   + 90 绿  + 0 绿  + 60   + 90 绿  + 0 绿  + 60   + 90 绿  + 0 绿  + 60   + 90 绿  + 注： +：一般， +：较好， +：最好。   12 （ 6）不同种类生长素对 不同 来源 材料 的 红腺忍冬生根壮苗的影响  据下表 7 可知， 生长素对红腺忍冬组培苗生根效果起 不可或缺的 关键 作用， 未添加生长素的 处理 培养至第 60d 时仍未 生根 ，继续追踪观察，未见生根 ； 就 同一浓度不同种类生长素培养 种子 继 代组培 苗而言， 生根率、平均根数及平均根长等各方面生根效果优略次序均为： ， 且  处理能在短期内促进生根，培养 30d 生根率可达 100%，优于其它处理，但  却不利于 腋芽初代诱导苗的生根，培养至第 60d 时 腋芽初代诱导苗 仍未生根， 继续培养 则 出现底端愈伤组织膨大，叶片及顶芽泛黄最终 导致枯萎死亡。 综上， 红腺忍冬组培 无菌 生根 苗 的优选 材料 ： 种子实生无菌 组培 苗芽，优选生根培养基： 1/2糖 30g/L+琼脂 6g/L+。  表 7  不同种类生长素对不同 来源材料 的红腺忍冬生根壮苗的影响  生长素种类及浓度 () 材料来源  培养天数（ d）  生根率（ %）  平均根数  （条 /株）  平均根长  （  根生长状况    种子继代组培苗  30   60 芽初代诱导苗  30   60 子继代组培苗  30 白 深绿