医学精品课件之抗生素高速逆流色谱分离纯化抗生素

高速逆流色谱分离纯化抗生素 郑 卫 （福建省微生物研究所 福州 350007） 内 容 提 要 一 高速逆流色谱技术简介 二 溶剂选择 在 逆流色谱中的重要性 三 高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例 一 高速逆流色谱技术简介 高速逆流色谱 (High Speed Counter Current Chromatography, HSCCC) a 多层盘绕管； b 平衡物 优缺点 （与 HPLC等液 -固色谱技术比较 ) 优点 分离原理不同：互补性强 无需固体作固定相 ： 不存在固体对样品组分的吸附、玷污、 变性、失活、拖尾等现象， 能实现很高的回收率， 节省昂 贵的材料消耗和溶剂消耗（ HPLC的 1/10以下），运行使 用的后续投入较低 溶剂极性可调：无需更换不同极性的色谱柱即可实现流动相 从弱极性到强极性或相反的转化 色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容积大：样品负 载能力强，制备量大，重现性好 盘管总体积 100mL， 一次分离量： 0.5-2克 盘管总体积 3000mL， 一次分离量： 15-60克 缺点 分离效率（理论塔板数）还不高（ 1.5 溶剂系统： 固定相保留率： 75% 表 1 最佳溶剂体系选择表 极性较弱溶剂 最佳溶剂 极性较强溶剂 heptane, CHCl3 THF H2O heptane, toluene, MiBK, CHCl3, EtOAc ACO H2O heptane methyl ethyl ketone H2O THF DMSO H2O toluene, MtBE, MiBK, EtOAc MeCN H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc BuOH H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc PrOH H2O heptane, CHCl3, EtOAc EtOH H2O heptane, toluene, CHCl3, EtOAc, BuOH MeOH H2O heptane, toluene, CHCl3, MiBK, EtOAc, BuOH HOAc H2O CHCl3 HCOOH H2O 非水体系 Heptane THF, DMF, EtOAc, PrOH, EtOH MeOH, MeCN 逆流色谱中常用的几个三元溶剂体系相图 Type 1: Chloroform / Methanol / Water 应用：杆菌肽 ， Niphimycin，克 念菌素 ， Herbicidins A, B等 l Type 2. Ethyl acetate / butanol / Water l 应用： WAP-8294A ， 弱极性样品 Type 0: Water / Dimethylsulfoxide / Tetrahydrofuran 应用： 极性强的难溶性样品如两性霉素 B CPC separation of Amphotericin B(peak 7) Water-DMSO-THF(24.6:16.2:59.2, V/V/V) 溶剂系统 的选择与优化 步骤 1:采用 简单的梯度洗脱系统如水 -乙腈 （ 100:00:100） 用 HPLC对样品进行极性扫描分析 ，得到样品的 极性范围 步骤 2:溶剂系统 的优化 区域 化合物 极性 溶剂系统 A 强 极性 正己烷 /正丁醇 /甲醇 /水 B 中 极性 正己烷 /乙酸乙酯 /甲醇 /水 C 非 极性 正己烷 /乙腈 步骤 3:溶剂比例 的优化 一次只改变一种 溶剂的量 取少量样品在试管中进行分配系数实验 TLC或 HPLC测定实验结果 实例：孢绿菌素 (Sporaviridins)的分离 Sporaviridins A1 A2 B1 B2 C1 C2 R1 H H H H OH OH R2 OH OH NH2 NH2 OH OH R3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 C2H5 CH3 孢绿菌素 ： 碱性，水溶性，抗 G+菌和毛 癣 菌等。 化学结构：含七个糖元的 34元大环内酯化合物，主要有 6个组分 ，由于结构非常相似，用 HPLC等方法难以分离。 溶解性：只溶于极性溶剂如水、甲醇和正丁醇等。 HSCCC方法： 溶剂系统选择： 正丁醇 /水：主要分布在上相（正丁醇），因此，必须降低孢绿 菌素在上相中的溶解度。方法：加入非极性溶剂如正己烷和 乙醚。 正丁醇 /乙醚 /水：先固定正丁醇和水的体积（各 10mL)， 加入不 同体积的乙醚，发现 10： 4： 10（ V/V/V)效果较好。再固定正 丁醇 /乙醚 10： 4，调整水的体积，确定正丁醇：乙醚：水为 10： 4： 12。 HSCCC： 固定相保留率： 75% ，分离时间： 3.5h， 洗脱体积： 500mL 分离前粗品 15mg， 分离后分别得到纯组分 A1(1.4mg), A2(0.6mg), B1(0.7mg), B2(0.5mg), C1(1.1mg), C2(1.4mg)。 HPLC separation of sporaviridins. Column: Cosmosil 5C18 (5 um, 150 mm*4.6 mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium chloride (74:26,v/v), flow rate:1ml/min, detection: 232 nm. 孢绿菌素各组分在正丁醇系统中的分配系数 分配系数 （ U/L） 正丁醇 /乙醚 /水 C2 B2 A2 C1 B1 A1 10:0:10 2.96 6.41 6.65 4.87 8.81 9.09 10:3:10 0.96 2.17 2.78 1.84 3.34 4.19 10:4:10 0.50 1.12 1.59 1.04 1.85 2.91 10:5:10 0.38 0.78 1.11 0.74 1.25 2.12 10:6:10 0.39 0.90 1.19 0.81 1.39 1.70 10:7:10 0.24 0.63 1.10 0.59 1.08 1.82 10:4:11 0.31 0.89 1.24 0.70 1.50 2.00 10:4:12 0.38 1.09 1.41 0.80 1.85 2.32 10:4:13 0.37 1.05 1.51 0.73 1.58 2.10 10:4:14 0.29 1.09 1.17 0.57 1.22 1.74 l HPLC separatin of each sporaviridin component. Column: Cosmosil 5C18 (5 um, 150 mm*4.6mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium choride (74:26, v/v), folw rate: 1ml/min,detection: 232 nm. 三 高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例 文献报道： 样品 溶剂系统 流动相 发表时间 肽类 短杆菌肽 A,B,C C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP 1982 多粘菌素 n-BuOH-0.04MTFA(1%glycerol) LP 1991 杆菌肽 CHCl3-MeOH-H2O LP 1991 CHCl3-EtOH-MeOH-H2O LP 1991 WAP-8294A n- BuOH-EtOAC-0.005M TFA LP 2001 放线菌素类 放线菌素混合物 Et2O-nC6H14-MeOH-H2O UP 1986 样品 溶剂系统 流动相 发表时间 大环内酯类 2-去甲基红霉素 nC5H12-C6H6-AcO-iPrOH -0.01M citrate buffer(pH6.3) UP 1988 尼达霉素 CCl4-MeOH-0.01MK3PO4 buffer(pH7) UP 1988 Tiacumicins CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1988 Coloradocin CHCl3-MeOH-H2O UP 1988 孢绿菌素 n-BuOH-Et2O- H2O LP 1990 霉菌素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-8%NH 3.H2O LP 1991 Dunaimycin n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 1991 原始霉素 CHCl3- EtOAc-MeOH-H2O UP 1992 伊维菌素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O LP 1996 螺旋霉素 n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 2000 样品 溶剂系统 流动相 发表时间 蒽环类 道诺红霉素衍生物 CHCl3-CH2Cl2-nC6H14- MeOH-H2O UP 1981 Benzanthrins A, B CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1986 Tetracenomycin D EtOAC-C6H12-MeOH-H2O UP 2005 多烯类 呋罗托霉素 CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985 克念菌素 CHCl3-MeOH-H2O UP 1987 头孢类 Cephalosporin C 流速： 1.5ml/min; 转速 : 900rpm; =K2： K1 = 0.69/0.43=1.60 溶 剂 比例 a上 (峰面 积 ) a下 (峰面 积 ) b上 (峰面 积 ) b下 (峰面 积 ) K1(a上 / a下 ) K2(b上 / b下 ) 3： 2： 2 2050105 2458306 3946083 3813162 0.83 1.03 3： 3： 2 3046107 7112647 2558036 3682147 0.43 0.69 3： 4： 2 3301481 13373343 1856063 6498237 0.25 0.29 分离前 分离后 异构体 2（顺 -反异构体） HPLC分析图 异构体 2分离的溶剂系统选择 (石油醚 /甲醇 /丙酮 /水 ） HSCCC分离 石油醚 /甲醇 /丙酮 /水 = 3： 1.5： 3： 2, 流动相： LP 固定相保留率： 83%; 流速： 2.0ml/min; 转速 : 900rpm; = K2/K1=1.28/0.83=1.54 溶 剂 比例 a上 (峰面 积 ) a下 (峰面 积 ) b上 (峰面 积 ) b下 (峰面 积 ) K1(a上 / a下 ) K2(b上 / b下 ) 3： 0.5： 3： 2 123