医学课件体液蛋白质检验

一、血浆蛋白质的组成、功能及分类 （一）血浆蛋白质的组成 血浆蛋白 质是血浆固体成份中含量最多、组成复 杂、功能广泛的一类化合物。占血浆固 体成份 90左右，目前已经研究的血浆 蛋白质有 500多种，分离出的纯品物 200 来种，除免疫球蛋白外，主要由肝细胞 合成。 第一节 概 述 （二）血浆蛋白质的功能 1. 维持血浆胶体渗透压 清蛋白。 2. 作为某些物质的载体 如清蛋白能 与多种物质结合（ FA、 胆红素），而某 些球蛋白具特异地运输某些物质的功能， 运铁蛋白、运皮质醇蛋白。 3. 维持体液 pH恒定 血浆蛋白 PI一 般都小于 7.4是弱酸，一部分的弱酸盐形 式存在，构成缓冲对。 4.免疫功能 血浆中汗多具有免疫功 能的球蛋白，主要由浆细胞合成，电泳时 位于 r区带，如 IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE， 此外，还有具有免疫作用的非特异 球蛋白，如补体。 5.凝血与纤溶作用 凝血与纤溶是一 对矛盾的统一、凝血因子与纤溶因子绝大 部分是血浆蛋白质，它们促进血液凝固， 防止血液流失和溶解血栓，防止重要脏器 的动脉栓塞。 6.营养作用 血浆蛋白质可分成 AA， 用于合成组织蛋白或氧化供能。 7.催化作用 血浆中有汗多酶类， 其中部分在血浆中发挥作用，称血浆功 能性酶，如凝血酶原、纤溶酶原、铜蓝 蛋白、 LPL、 LCAT、 肾素等。 二、个别血浆蛋白质 （一）前血蛋白 （ pueallumun PA） 分子 量 5.4万，由肝细胞合成，电脉时移速较白蛋 白快，位于其前方面得名，半寿期短 12h， PA 是一类运载蛋白，一种能与甲状腺素结合， 称为甲状腺结合蛋白，一种能与 VitA结合， 称为 VitA结合蛋白，常用测定方法是免疫化 学方法， 【 参考范围 】 0.2 0.4g/L, 【 临床意义 】 急性炎症，恶性肿瘤，肝硬 化或肾炎时下降。 （二）白蛋白 （ allumim, ALb） 分子量 66458，由肝实质细胞合成，半寿期 15 19天 ， 是血浆中含量最多的蛋白质，占 40 60 ，主要功能，维持血浆胶体渗透性，缓冲 作用，运输作用，营养作用，调节某些激素 或药物活性。 白蛋白可微量地通过肾小球，约 0.04 ，但大部分被血小管重吸收。白蛋白的测定 方法目前主要是溴甲酚绿（ BCG） 法。 【 参考范围 】 35 55g/L 【 临床意义 】 血浆白蛋白增高临床少见 ，主要见于严重失水引起血液浓缩。血浆白 蛋白降低临床常见。 合成障碍急、慢性肝 炎。 丢失过多，肾病综合症、慢性肾小球 、肾炎、糖尿病、系统性斑狼疮等。 分解 过多，营养不良，慢性胃肠道疾病。 （三） 1-抗胰蛋白酶 （ 1AT或 AAT）， 分子量 5.5万， pI4.8， 含糖 10 12，电泳 时位于 1区带，占 90左右， 由肝细胞合成 ，能抑制多种酶活性， 尤其是蛋白酶，占血 清中抑制蛋白酶活力的 90左右，抑制作用 有明显的 pH依赖性，在中性和弱碱性中活力 最大。 AAT也是一种急性时相反应蛋白，主要 功能是对抗多形核蛋白细胞吞噬作用时释放 的溶酶体蛋白水解酶。 AAT测定方法 目前主要采用免疫 化学法。 【 参考范围 】 成人 0.83 2.0g/L， 【 临床意义 】 AAT下降见于胎儿呼 吸窘迫症， AAT缺陷所致的肺气肿、肝 硬化等。 AAT上升见于急性炎症、外科 手术后，长期服用可的松药物，妊娠及 服用避孕药物。 （四） 1-酸性糖蛋白 （ -AG或 AAG） 分 子量约 4万，含糖约 45， pI2.7 3.5， 主要 由肝细胞合成，某些肿瘤组织也可合成。 AAG是主要的急性相反应蛋白 ，急性炎症时 上升，与免疫防御功能有关。 AAG测定方法 使用 AAG抗体，进行免 疫散法或免疫比浊法检测， 【 参考范围 】 0.25 2.0g/L 【 临床意义 】 主要作为急必时相反应的指 标，风湿病、恶性肿瘤、心肌梗塞患者上升 ，营养不良、严重肝病下降。 （五）甲胎蛋白（ AFP） 分子量 6.5 7万 ， pI4.75， 含糖量 4，主要在胎儿肝合成， 妊娠 13 15周血清 AFP含量最高，以后逐渐 下降，出生时仅为高峰期的 1，周岁时接近 成人水平，仅 10 30g/L， 功能不详。 AFP测定方法 火箭电泳放射自显影； 放射免疫法（ RIA）； 酶联免疫吸附法（ ELISA） 灵敏度接近放免，且操作简便，无 放射污染，便于推广。 【 参考范围 】 10 30g/L 【 临床意义 】 AFP作为肿瘤标志物，对原 发性肝癌的诊断很有价值， 80以上原发性 肝癌患者血清 AFP上升，但无特异性，肺癌 、胰腺癌，肝硬化患者血清 AFP亦升高，此 外，羊水 AFP含量测定可用于胎儿产前监测 ， AFP增高，提示胎儿畸形（神经管缺损、 脊柱裂、无脑儿）死胎。 （六）结合球蛋白（ Hp） 又名触珠蛋 白，是一种糖蛋白，主要由肝合成，电泳 时位于 2区带， 是一种急性时相反应蛋白 ，为两对肽链组成的四聚体（ 22）。 链 有 1和 2两种，其中 1有两种遗传变异体 。 Hp的主要功能与血浆中游离血红蛋白 结合，（不可逆结合），并送至肝细胞内 降解，因此 Hp在溶血后含量急剧下降。 血浆 Hp测定方法 测定 Hp-Hb复合物 中过氧化物酶活性。 在血浆中加入过量 Hb ， 生成 Hp-Hb复合物，凝胶层折法收复合物 分离，测定结合的 Hb。 电泳法。 免疫化 学法。 【 参考范围 】 0.5 2.2g/L 【 临床意义 】 急性时相反应中血浆 Hp上 升，烧伤、肾病综合征引起 Alb丢失时 Hp上 升，血管内溶血 Hp下降。 （七） 2-巨球蛋白（ 2MG或 AMG） 是血 浆中分子量最大的蛋白质，分子量为 62.5 80 万，含糖量 8。 AMG由肝细胞与单核吞噬细 胞系统合成，半寿期 5天。 AMG最突出的特性能与多种分子和离子 结合，特别是它能与不少蛋白水解酶结合而影 响这些酶的活性，有选择地保护某些蛋白酶活 性的作用。 AMG测定方法 免疫化学法， 【 参考范围 】 1.25 4.10g/L 【 临床意义 】 在低蛋白血症， AMG上升， 妊娠、服用避孕药时 AMG上升。 （八）铜蓝蛋白（ CER） 含铜的糖蛋白，分 子量约 12 16万，含糖量约 10，因含铜而呈蓝 色，故名铜蓝蛋白。主要由肝脏合成。 CER具有氧化酶活性，使血液中 Fe2+氧化成 Fe3+， 故又称亚铁氧化酶。 CER还起着抗氧化剂 的作用。防止组织中脂质过氧化物和自由基的生 成。 CER测定方法 免疫化学法或酶活性测定。 【 参考范围 】 0.2 0.5g/L。 【 临床意义 】 CER属于急性时相反应蛋白。 在感染、创伤和肿瘤时上升， Wilson 病（肝豆状 核变性） CER下降。 （九）转铁蛋白（ TRF） 血浆中主要含铁 蛋白质，分子量 7.7万，含糖约 6，由肝及网 状皮系统合成，半寿期 7天。 主要运载由消化道吸收的铁和 RBC降解释 放的铁，此外还可逆地结合多价金属离子，如 Ca、 Zn、 Cu等。 TRF测定方法 放免法、散射比浊法。 【 参考范围 】 2.5 4.3g/L。 【 临床意义 】 TRF在急性时反应中下降，如 炎症、恶性病变时、 TRF、 Alb、 PA同时下降 ，慢性肝现营养不良亦下降，妊娠、口服避孕 药，注射雌激素 TRF上升。 （十） 2-微球蛋白（ BMG） 由淋巴细胞合 成，分子量 11800， pI5.7， 存在于所有有核细胞 的表面，特别是淋巴细胞和肿瘤细胞并由此释放 入血，半寿期 107min。 BMG测定方法 常用放免法， ELISA法。 【 参考范围 】 1.0 2.5mg/L。 【 临床意义 】 主要用于监测肾小管功能，特 别是肾移植后，如有排异反应， BMG在尿中排 出量上升，肾功能衰竭，炎症、肿瘤血浆 BMG 上升。 （十一） C-反应蛋白（ CRP） 是一种能结合 肺炎双球菌细胞壁 C-多糖的蛋白质，分子量 11.5 14万，五条肽链组成，肝细胞合成。 CRP能激 活补体，促进粒细胞、巨噬细胞的运动和吞噬， 具有调理素样作用。 CRP测定方法 免疫扩散法，火箭免疫电泳 法， ELISA法，放免法， 【 参考范围 】 8.0mg/L。 【 临床意义 】 作为急性时相反应的一个极灵 敏指标 ，急性心肌梗死，创伤、感染、炎症、外 科手术、肿瘤浸润迅速上升。 上述蛋白质除 PA、 Alb、 BMG 外都属于糖蛋白，含糖量最高的是 AAG、 45，除 BMG外都主要由肝 细胞合成。 三、疾病时的血浆蛋白质 （一）炎症、创伤 在炎症、创伤、感染、心肌梗塞、肿瘤 等情况下其血浆浓度会发生明显改变的蛋白 质称为急性时相反应蛋白 （ acute phase reactants APR）。 主要包括 AAG、 AAT、 Hp、 CER、 C3、 C4、 纤维蛋白原、 CRP； PA、 Alb、 TRF。 （ 二） 肝脏疾病 血浆蛋白质大多数由肝脏合成，因此肝 脏疾病可导致多种血浆蛋白质发生变化。 如乙肝活动期 AAT， Hp、 PA、 Alb， 特别是血浆 PA的含量是肝功能损伤的敏感指 标。 肝硬化时 AAT、 IgA、 AMG， CER、 CRP，而 AAG、 Hp、 C3， PA、 Alb、 TRF。 （三）肾脏疾病 肾脏疾病可出现蛋白尿而导致血浆蛋 白质丢失，丢失的蛋白质与其分子量有关 。小分子量蛋白质丢失最明显，而大分子 量的蛋白质因肝细胞代偿性地合成增加， 绝对含量升高。所以血浆 Alb、 PA、 AAG 、 AAT、 TRF，而 AMG、 -LP、 Hp， 这称为选择性蛋白质丢失。 当严重肾病是肾小球失去分子筛作用 ，可导致非选择性蛋白质丢失，表现为广 泛地低血浆蛋白质血症。 生化检验中测定蛋白质的方法很多，主 要利用蛋白质的分子组成，结构或性质进行 。 一、蛋白质测定方法及评价 （一）测定蛋白质特征元素 氮 如 凯 氏定氮法 ，是测定蛋白质的经典方法， 1883 年 Kjeldahl首创，精密度准确度高，但操作复 杂、费时、技术性强，不适合临床常规检测 ，一般 用于标准血清的标定和校正 。 第二节 体液蛋白质测定 （二）利用重复的肽链结构 如 双 缩脲法 ， 1914年首创，操作简便，重 复性好，各种蛋白产生的颜色反应相 近，但灵敏度较低，是目前临床上 测 定总蛋白的常规方法 。 （三）利用酪氨酸、色氨酸残基与试剂的反 应或紫外吸收特性 1. 酚试剂法 1921年， Folin首创， 1951 年改良成广泛使用的 Lowry法，灵敏度高（较双 缩脲法高 100倍），主要用于微量蛋白质检测， 但各种蛋白质中酪氨酸含量不一，故准确性较差 ，试剂配制复杂且不稳定，化学干扰大，目前临 床上仅 用于粘蛋白测定 。 2. 紫外吸收法 在 280nm处有一吸收峰，快 速、简单，不需加任何试剂，保留蛋白质活性， 化学干扰大。 （四）利用与染料的结合能力 1. 考马斯亮蓝 G-250结合蛋白法（ CBB法） 1976年 Bradford应用于蛋白质测定，操作简便、 快速、重复性好，灵敏度高，干扰因素少，但特 异性不高，大分子肽（分子量 300以上），也参 与反应，线性范围窄，临床上主要 用于尿、脑脊 液蛋白质测定 。 2. 溴甲酚绿结合清蛋白法（ BCG法） 灵敏 度高，血清用量少，操作简便，但特异性不高， 部分球蛋白也能与之结合（ 1-球蛋白、运铁蛋 白、触珠蛋白等），是目前临床上 测定清蛋白的 常规方法 。 （五）利用沉淀后借浊度或光折射测定 如 比浊法、折光测定法，方法简便，试剂易得， 但浊度的强弱受反应的条件影响大（加试剂的 方法、温度等），结果准确性差，一般用于 尿 、脑脊液蛋白测定 。 （六）电泳法 CAE、 PAGE目前临床上常 用电泳技术，但只能 测定各种蛋白质的百分含 量 。 （七）利用免疫学特性 免疫化学法，特异 性、灵敏度高，只能 用于某种特异蛋白的测定 。 二、血清总蛋白的测定（双缩脲法） 【 原理 】 蛋白质分子中的肽链在碱性条 件下能与二价铜离子作用生成紫红色的络合 物，产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质 的含量成正比，但双缩脲反应并非蛋白质特 有的颜色反应，分子中含二个以上肽键者均 有此反应。 【 试剂 】 双缩脲试剂 未失结晶水的硫酸 铜（ CuSO45H2O） 3.0g溶于 500ml新鲜制备的蒸 馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钾钠 （ NaKC4O4H64H2O） 9.0g， 碘化钾 5.0g， 待完 全溶解后加入 6mol/L NaOH溶液 100ml， 最后加 蒸馏水至 1L， 置聚乙烯瓶内盖紧保存。 酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，维持铜离 子在碱性溶液中的溶解度，碘化钾防止两价铜离 子还原。 【 参考范围 】 60 80g/L 【 临床意义 】 （一）血清总蛋白增高 1. 血液浓缩 严重腹泻 、呕吐、高烧 2. 合成增加 主要见于球蛋白合成增加，多发性 骨髓瘤。 （二）血清总蛋白降低 1.血液稀释 静脉滴注过多低渗溶液，各种原因 所引起的水钠潴留。 2. 摄入不足和消耗增加 营养不良，慢性胃肠道 疾病引起的消化吸收不良，消耗性疾病，结核病、甲 亢、恶性肿瘤。 3. 合成障碍 主要见于肝脏疾患。 4. 蛋白质丢失 严重烧伤，大量血浆渗出，肾病 综合症。 三、血清清蛋白测定（溴甲酚绿法） 【 原理 】 溴甲酚绿（ BCG）在 pH4.2的环境 中，在有非离子去垢剂（ Brij-35） 存在时，可与 清蛋白结合形成蓝绿色复合物，颜色的深浅在一 不定范围内与清蛋白含量成正比。 BCG与清蛋白结合的特异性较低，它不仅 与 Alb结合呈色，还可与其他蛋白质呈色，其中 1-球蛋白， TRF、 Hp最明显，但反应速度不同 ， Alb可立即反应（快反应），其他蛋白质反应 慢（慢反应）。 【 试剂 】 1. 10mmol/L BCG贮存液 BCG1.75g， 溶 于 5ml 1 mol/L NaoH溶液中，加蒸馏水至 250ml 。 2. 0.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液（ pH 4.0） NaoH10g， 琥珀酸 56g， 溶解于 800ml蒸馏水中， 用 1mol/L NaoH溶液调 pH至 4.100.05加蒸馏水 至 1L。 3. 叠氮钠贮存液 叠氮钠 40g溶于 1000ml蒸 馏水中。 4. Brij-35溶液 Brij-35 29g， 加蒸馏水 80ml， 置 80ml左右水溶使其溶解，然后加水至 100ml。 5. BCG试剂 于 IL容量瓶内加蒸馏水 400ml， 琥珀酸缓冲贮存液 100ml， BCG贮存 液 8ml， 叠氮钠贮存液 2.5ml， Brij-35溶液 2.5ml， 加蒸馏水至刻度，配好的 BCG试剂的 pH应为 4.150