生物技术综合实验

生物技术综合实验 Comprehensive experiments of biotechnology 主要内容 Contents： 一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid 二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction 四、 DNA序列测定 DNA Sequencing 五、分子杂交技术 Molecular Hybridization Southern,Northern and Western Blot 六、基因文库和 cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆与表达 Heterogenic Gene Cloning and Expression 八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用 的基本技术方法之一。 杂交是指亲源关系相近的不同来源的 DNA单链或 DNA单链与 RNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子 的过程。 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单 链在一定的条件下 (适宜的温度及离子强度等 )可按 碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特 异性的。 Part 5 分子杂交 Molecular Hybridization (DNA,RNA 非特异性地吸附蛋白质的作用较弱，因此特别适合 于那些涉及蛋白质作用 (如抗体和酶等 )的非放射性 标记探针的杂交体系。 因为硝酸纤维素膜是依靠疏水性相互作用结合 DNA的 ，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜的进程， DNA会慢慢脱离硝酸纤维素膜，特别是高温情况下， 从而使杂交效率下降。因此不太适宜于在同一膜上重 复进行杂交。再者，硝酸纤维素膜质地较脆，特别是 经烘烤后，操作不方便，须特别小心。 缺点： (2)尼龙膜 (nylonmembrane)： 尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物，它 有多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经 特殊处理，有些则是经过了正电荷基团的修饰。这种 修饰的尼龙膜结合核酸的能力更强。 结合核酸的能力强，对于小分子量 DNA片段 (特别是 试剂： 10MSE 缓冲液： 0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（ MOPS）， pH7.0， 50mmol/L醋酸钠， 1mmol/L EDTA pH8.0 。 5 载样缓冲液： 50%甘油， 1mmol/L EDTA， 0.4%溴酚蓝。 甲醛：用水配成 37%浓度（ 12.3mol/L）， 应在通风柜中操 作， pH高于 4.0。 20SSC ； 去离子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含 10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris， pH7.5。 步骤： 140ml水中加 7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到 60 ，加 7ml 10MSE 缓冲液， 11.5ml 甲醛，加水定容至 70ml，混匀后 倒入盛胶槽。 2等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入 1MSE 缓冲 液的电泳槽。 3使 RNA变性（最多 20g ）， RNA4.5l,10MSE 缓冲液 2l ，甲醛 3.5 l ，去离子甲酰胺 10 l 。 455 加热 15min，冰浴冷却。 5加 2ml5 载样缓冲液。 6上样、同时加 RNA标记物。 760伏电泳过夜。 8取出凝胶，水中浸泡 2次，每次 5min。 9室温下将胶浸到 50mmol/L NaOH和 10mmol/L NaCl中 45min， 水解高分子 RNA， 以增强 转印。 10室温下将胶浸到 0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中 45min,使胶中和。 1120SSC 洗胶 1h。 1220SSC 中过夜转印到硝酸纤维素膜上。 13取出硝酸纤维素膜， 80 真空烘烤 2h。 RNA extraction and isolation 5 10g isolated RNA 260/280nm 2.0 (c.f. DNA 1.8) Northern Blotting Denaturing agarose gel electrophoresis 甲醛 Formaldehyde 0.66M/2.2mM 乙二醛 Glyoxal /氢氧化甲基汞 Methyl Mercuric Hydroxide Heat in formamide to denature Blot/transfer the RNA onto a membrane using salt solution RNA transferred to nylon or nitrocellulose membrane/filter Probe can be radiolabelled or chemiluminescent. Random priming is the usual method for generating a labelled probeHybridization buffer is important as is stringency of washing (Rapid Hyb 1hr) Northern Blotting Northern Blotting Probe can be washed off the membrane which can be reprobed or multi-probed. Use a housekeeping type to probe to analyse changes Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH三磷酸甘油醛 脱氢酶 ), -actin, 2-microglobulin 5组织原位杂交 （ in situ hybridization） n 简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位 杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出 DNA， 然后进行 杂交，而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加， 让探针进入细胞内与 DNA或 RNA杂交，因此原位杂交可以确 定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生 物学和病理学意义。例如，对致密染色体 DNA的原位杂交 可用于显示按规定序列的位置，对分裂期间核 DNA的杂交 可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞 RNA的杂 交可精确分析任何一种 RNA在细胞中和组织中的分布。用 来检测组织、细胞或染色体上的特殊 DNA序列或 mRNA的表 达水平。 n 用来检测组织、细胞或染色体上的特殊 DNA序列或 mRNA的 表达水平。最初是使用带放射性的 DNA或 RNA探针，通过 放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将 探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被 带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置 n 用于原位杂交的探针可以是单链或双链 DNA， 也可以是 RNA探 针。通常探针操作的长度以 100-400nt为宜，过长则杂交率减 低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（ 16-30 nt） 能自由 出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针，因此， 寡核苷酸探针和不对称 PCR标记的小 DNA探针或体外转录标记 的 RNA探针是组织原位杂交优选探针。 n 探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物 素和半抗原等，放射性同位素中， 3H和 35S最为常用， 3H标记 的探针半衰期长，成像分辨率高，便于定位，缺点是能量低 ， 35S标记探针活性较高，影像分辨率也较好，而 32P能量过 高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。 n 原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要 因素。标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极 为重要，去除蛋白质的方法是，用 0.2mol/L HCl处理 载玻片，用蛋白酶 K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水 。原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、 特异性、稳定性上还需进一步完善和提高。 6 Western Blot n 1 原理 ： n 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤 维素（ NC)或 聚偏氟乙烯膜 （ PVDF)膜上，然后与能特异 性识别待检蛋白的抗体（一抗）进行反应，洗涤去除没 有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗 体的种属特异性抗体（二抗），反应一段时间后再次洗 涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检 测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的 出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半 定量。 2 操作过程 n SDS-PAGE电泳 转膜（ PVDF或硝酸纤维素膜） n 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 n 洗涤 显色或化学发光显影 Hours 0 4 8 16 Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control 0h 4h 8h 16h Western Blot analysis of cytochrome C release. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol- treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10M gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. Cyto-C X-Protein 3 注意的问题 n （ 1） 蛋白质电泳 n 常用 SDS-PAGE： 单一亚基组成的蛋白质 n 非变性 PAGE： 多个不同亚基组成的蛋白质 n Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于 10kDa的多肽 和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。 n Tricine電泳膠將 buffer中的 glycine置換為 Trycine， 並降低 pH值至 pH7， 使得小分子蛋白質與胜月太在 stacking gel中可移動較 DS快 ， 因此在分析膠體中可有 明顯的分離效果。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 （ 2）转膜 n 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂 会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致。 n 以适量的转移 Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜 15 30min ， 如果是 PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 n 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极。 n 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 n 电转时间： 100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活选择 。 n 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率。 n 膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置 （ 3）封闭 n 用 5脱脂奶粉或 3 BSA （ 含 0.1 Tween20 TBS或 PBS配制） n 时间：室温 2h或 4C过夜 （ 4）显色或显影 n 显色 n 辣根过氧化物酶：底物为联苯胺 DAB n 碱性磷酸酶：底物为 5-溴 -4-氯 -3-吲哚磷酸二钠 （ BCIP） /硝基四氮唑兰（ NBT） n