分析化学第十一章吸光光度法

第十一章 吸光光度法 n第十一章第十一章 吸光光度法吸光光度法 n 吸光光度法（ Absorption photometry） 是一种基 于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法 。包括 可见吸光光度法 、紫外 -可见吸光光度法和红外 光谱法等，也叫分光光度法 (spectrophotometry)、 比 色法。 吸光光度法同滴定分析法、重量分析法相比， 有以下一些特点： n (一 )灵敏度高 吸光光度法测定物质的浓度下限 ( 最低浓度 )一般可达 1-10-3% 的微量组分。如果对被测 组分事先加以 富集，灵敏度还可以提高 1-2个数量级。 1 第十一章 吸光光度法 n (二 )准确度较高 一般吸光光度法的相对 误差为 1-5% ，其准确度虽不如滴定分析法及重量 法，但对微量成分来说，还是比较满意的，因为 在这种情况下，滴定分析法和重量法也不够准确 了，甚至无法进行测定。 n (三 )操作简便，测定速度快 (批量样品测定 ) n (四 )应用广泛 几乎所有的无机离子和有机 化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定 。 n 基于上述特点，吸光光度法被称作现代分析 化学的 “常规武器 ”。 2 第十一章 吸光光度法 一、 物质对光的选择性吸收 （一）单色光和复合光 n 光是一种电磁波 , 按其波长可分为不同区 域： 第一节吸光光度法基本原理 l g 射 线 x 射 线 紫 外 光 红 外 光 微 波 无 线 电 波 10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm 可 见 光 可见光： 400 750nm 3 第十一章 吸光光度法 光波具有波粒二象性。 其波长 、频率 与速度 c之间的关系为： E= = c/ 为普朗克常数，其值为 6.6310-34Js。 普朗克方程表示了光的波动性和粒子性之 间的关系。 显然，不同波长的光具有不同的能量 ，波长愈短，能量愈高；波长愈长，能量 愈低。 4 第十一章 吸光光度法 单色光 理论上单色光是具有相同波长的光，但 通常意义的单色光是指其波长处于很窄 的某一范围的光。 复合光 由不同单色光组成，如阳光和白炽灯泡 发出的光均为复合光。 可见光 400 750nm 5 第十一章 吸光光度法 所谓 可见光 是指人的眼睛 所能感觉到的波长范围为 400 750nm的电磁波。当 一束阳光 (即白光 )通过棱 镜后就色散成红、橙、黄 、绿、青、蓝、紫等颜色 的光，它们具有不同的波 长范围。反之，这些不同 颜色的光依照强度按一定 的比例混合后，便又形成 白光。进一步的研究表明 ，只需将对角线上两种颜 色的光依强度按一定的比 例混合就可形成白光，它 们称为互补色光。阳光、 白炽灯光等白光便是由一 对对互补色光依强度按一 定比例混合而成的。 6 第十一章 吸光光度法 (一 ) 物质对光产生选择性吸收和原因 n 在一般情况下，物质的分子都处于能量最低、最 稳定的状态 基态 。当用光照射某物质后，如果照 射光具有的能量恰与物质的粒子从基态到激发态的能 级差相等时，这一波长的光即可被分子吸收，从而使 其产生能级跃迁而进入较高的能态 激发态 。也就 是说，并不是任一波长的光都可以被某一物质所吸收 。由于不同物质的分子其组成和结构不同，它们所具 有的特征能级差不同，而各物质只能吸收与它们分子 内部能级差相当的一定波长的光辐射，所以不同物质 对不同波长的光具有选择性吸收。 二、物质对光的选择性吸收 7 第十一章 吸光光度法 物质颜色与吸收光颜色的关系 return （二） 8 第十一章 吸光光度法 n 对固体物质来说， 当白光照射到物质上时 ，物质对于不同波长的光吸收、透过、反射 、折射的程度不同而使物质呈现出不同的颜 色。如果物质对各种波长的光 完全吸收 ，则 呈现 黑色 ；如果 完全反射 ，则呈现 白色 ；如 果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现 灰色；如果物质选择性地吸收某些波长的光 ，那么，这种物质的颜色就由它所反射或透 过光的颜色来决定。 9 第十一章 吸光光度法 n 对溶液来说 ， 溶液呈现不同的颜色，是由于溶 液中的质点 (分子或离子 )选择性的吸收某种颜色的光 所引起的。如果各种颜色的光透过程度相同，这种物 质就是无色透明的。如果只让一部分波长的光透过， 其它波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色 ，也就是 溶液呈现的是与它吸收的光成互补色的颜色 。例如硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈蓝色 ；高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而呈现紫色 。其实，任何一种溶液对不同波长的光的吸收程度 是不相等的。 用不同波长的单色光照射某一物质测定 吸光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制 成的曲线 叫做 吸收光谱曲线或光吸收曲线 。它清楚地 描述了溶液对不同波长的光的吸收情况。 10 第十一章 吸光光度法 吸收曲线的特点： 不同的物质因其分子结 构不同而具有不同形状的吸 收曲线； 同一物质，浓度不同，其 吸收曲线的形状和 max的位 置不变，但在同一波长下吸 光度随浓度的增大而增大。 吸收曲线是吸光度法选择测 量波长的依据。吸收 曲 线 图 400 500 600 0.200 0.300 0.400 0.100 A 第十一章 吸光光度法 在可见光， KMnO4溶液对波 长 525 nm附近绿色光的吸收 最强，而对紫色和红色的吸 收很弱。 max=525 nm。 对于同一物质 , 当它的浓度不 同时 ,它的 max值固定不变（ 据此进行物质的定性分析） , 但吸光度 A的大小不同 ,并随 着其浓度的增加 , 吸光度 A 也 相应成一定比例地增大（据 此进行物质的定量分析）吸 光度 A随浓度变化在 max处 最灵敏 。 浓度 最高 浓度 最低 第十一章 吸光光度法 二 .朗伯 -比耳定律 (一 )、朗伯 -比耳定律的数学表达式 朗伯 (Lambert J H)和比尔 (Beer A)分别 于 1760和 1852年研究了光的吸收与溶液层的 厚度及溶液浓度的定量关系，二者结合称为 朗伯 -比尔定律，也称为光的吸收定律 。 当一束强度为 I0的平行单色光垂直照射到厚 度为 b的液层、浓度为 c的溶液时，由于溶液 中吸光质点 (分子或离子 )的吸收，通过溶液后 光的强度减弱为 I： 第十一章 吸光光度法 n A=Kbc n 此式为 朗伯 比尔 定律的数学表达式。 n 式中 A称为吸光度， K是比例常数，与入 射光的波长、物质的性质和溶液的温度等因素有 关。 n I/I0称为透光率，用 T表示。它与 A的关系 为： 14 第十一章 吸光光度法 朗伯 -比尔定律表明：当一束单色光通过含有吸 光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的 浓度及吸收层厚度成正比。这是进行定量分析 的理论基础。比例常数 K当 C采用不同单位时 ,K的数值也不同： C以 g/L表示 ,K就以 a表示 ,称 吸 收 系数 , 这时朗伯 -比耳定律变为： A abc C以 mol/L表示 ,K就以 表示 ,称 摩尔吸光系数 . 这时朗伯 -比耳定律就变为 : 15 第十一章 吸光光度法 n A bc n 的物理意 义 ： 它表示物质的量浓度为 l mol/L， 液层厚度为 l cm时吸光物质对某波长光的吸光度。 n 越大，表明用光度法 测 定 该 物 质 的灵敏度越高 。 n 桑德尔灵敏度 n 吸光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数 表示 外，还常用 桑德尔灵敏度 S表示 。 n S定义：当光度仪器的检测极限为 A=0.001时，单 位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量（ gcm-2）。 16 第十一章 吸光光度法 S与 及吸光物质摩尔质量 M的关 系为： n n可见，某物质的摩尔吸光系数 k越大，其 桑德尔灵敏度 S越小，即该测定方法的灵敏 度越高。 17 第十一章 吸光光度法 朗伯 比尔定律的物理意义和适用范围 n 当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散 射的吸光物质时，其吸光度 A与吸光物质的浓度 c 及吸收层厚度 b成正比。这正是吸光光度法进行 定量分析的理论依据。 n 朗伯 比尔定律是光吸收的基本定律，适 用于所有的电磁辐射与所有的吸光物质 (可以是气 体、固体、液体、原子、分子和离子 )间的作用。 但由推导过程中所确定的假设可知，朗伯 比尔 定律的成立是有前提的，即 (1)入射光为平行单色 光且垂直照射； (2)吸光物质为均匀非散射体系； (3)吸光质点之间无相互作用； (4)辐射与物质之间 的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象 发生。 18 第十一章 吸光光度法 n 二、引起偏离朗伯 -比耳定律的原因 n (一 )物理因素 n 1.单色光不纯所引起的偏离 n 严格地讲，朗伯 -比耳定律只对一定波长的单 色光才成立。但在实际工作中，目前用各种方法得 到的入射光并非纯的单色光，而是具有一定波长范 围的单色光。那么，在这种情况下，吸光度与浓度 并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯 比耳定 律的偏离。 n 2.非平行入射光引起的偏离 n 非平行入射光将导致光束的平均光程 b 大于 吸收池的厚度 b， 实际测得的吸光度将大于理论值。 19 第十一章 吸光光度法 n 3介质不均匀性引起的偏离 n 朗伯 -比耳定律是建立在均匀、非散射基 础上的一般规律、如果介质不均匀，呈胶体 、乳浊、悬浮状态存在，则入射光除了被吸 收之外、还会有反射、散射作用。在这种情 况下，物质表现出的吸光度比实际的吸光度 大得多（因为透过光小了），必然要导致对 朗伯 -比耳定律的偏离。 20 第十一章 吸光光度法 n （二）化学因素 n 1溶液浓度过高引起的偏离 n 朗伯 -比耳定律是建立在吸光质点之间没有 相互作用的前提下。但当溶液浓度较高时，吸光 物质的分子或离子间的平均距离减小，相互作用 增强，从而改变物质对光的吸收能力，即改变物 质的摩尔吸收系数。 n 2. 化学变化所引起的偏离 n 溶液中吸光物质发生化学反应，吸光质点 的浓度不等于其分析浓度，也就破坏了吸光度 A 与分析浓度之间的 线性关系 。产生对朗伯 -比耳定 律的偏离。 21 第十一章 吸光光度法 分光光度仪器的基本部件 光源 单色器 吸收池 检测系统 稳压电源 第二节 吸光光度法的仪器 第十一章 吸光光度法 分光光度计的主要部件 光源： 发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度 ,稳定。 可见光区： 钨灯，碘 钨灯 (320 2500nm) 紫外区： 氢灯，氘灯 (180 375nm) 氙灯 ： 紫外、可见光区 均可用作光源 l/nm 钨灯（ 热辐射光源 ） 400 600 800 1000 氙灯 （ 气体放电光源 ） 氢灯 强度 第十一章 吸光光度法 氙灯 氢灯 钨灯 第十一章 吸光光度法 单色器： 将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。 棱镜： 依据不同波长光通过棱镜时折射率不同 . 玻璃 350 3200nm, 石英 185 4000 nm 入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝 白光 红 紫 1 2 800 600 500 400 第十一章 吸光光度法 光栅： 在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的 等宽度等 间距 条 痕 (600、 1200、 2400条 /mm )。 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。 波长范围宽 , 色散均匀 , 分辨性能好 , 使用方便 . 光栅衍射示意图 M1 M2 出 射 狭 缝 光屏 透 镜 平面透 射光栅 第十一章 吸光光度法 吸收池 (比色皿 )：用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光 学玻璃池 紫外区：石英 池 检流计 （指示器）： 低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录 检测器 ： 利用光电效应，将光能转换成 电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管 I0 It 第十一章 吸光光度法 吸 光 系数 C以 g/L表示 A a b c A b cC以 mol/L表示 摩尔吸光系数 越大，光度法测定 该物质的灵敏度越高 。 影响 因素：温度、 波长、吸光物质性质 。 朗伯 -比尔定律： 摩尔吸光系数 与 桑德尔灵敏 度关系： 吸收系数 28 第十一章 吸光光度法 n 第三节第三节 显色反应及其影响因素 n 一、显色反应的类型及要求 n 显色反应 -将试样中被测组分转变成有色 化合物的反应。 n 显色反应主要两大类 :络合反应 (为主 ) n 氧化还原反应 29 第十一章 吸光光度法 n 选择显色反应的一般标准选择显色反应的一般标准 : n (1) 选择性要好。 n 一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应 ; n 干扰离子容易被消除 ; n 显色剂与被测组分和显色剂与干扰离子生成的有 色化合物的 max相隔较远。 n (2)灵敏度要高。 由于吸光光度法一般是测定微量 组分的，所以要选 值大灵敏度高的。但应注意，灵 敏度高的不一定选择性就好，对于高含量的组分不 一定要选用灵敏度高的显色反应。 n (3)对比度要大。 即如果显色剂有颜色，则生成的 有色化合物与显色剂本身的 max差别要大，一般要 求在 60nm以上。 30 第十一章 吸光光度法 n (4)有色化合物的组成要恒定 ,化学性质要稳定。 n 有色化合物若易受空气的氧化、日光的照 射而分解，测定的误差较大。 n (5)显色反应的条件要易于控制 。 n 如果条件要求过于苛刻，难以控制，测定 结果的再现性就差。 31 第十一章 吸光光度法 n 二、常用显色剂 （自己看） n 三、影响显色反应的因素 n 1.显色剂的用量 n 显色就是将被测组分转变成有色化合物 ，表示： n M + R = MR n (被测组分 ) (显色剂 ) (有色化合物 ) n 反应在一定程度上是可逆的。 n 根据同离子效应，应加入过量的显色剂， n 不能过量太多，否则会引起副反应 （图 11-5） 。 32 第十一章 吸光光度法 n 2.溶液的酸度 n 酸度对显色反应的影响表现在以下三方面 : n (1)影响被测物质的存在状态 n 大部分高价金属离子都容易水解，会产 生一系列羟基络离子或多核羟基络离子，最终 有可能生成沉淀。故溶液的酸度不能太低。 33 第十一章 吸光光度法 n (2) 影响显色剂浓度和颜色 n 光度分析中所用的大部分显色剂都是 有机弱酸。显色反应进行时，首先是有机弱 酸发生离解，其次才是络阴离子与金属离子 络合。 n HR（显色剂） R- + H+ n + n M MR n 从反应式可以看出，溶液的酸度影响着显 色剂的解离 ,也影响着显色配位反应的完全 程度。 34 第十一章 吸光光度法 n 还要注意 ： 许多显色剂当溶液酸度改变 时，显色剂本身就有颜色变化。如果显色剂在某 一酸度时，显色络合物的颜色和其本身颜色相同 就无法进行光度测定。 n 例如 n pH 6.3呈 柠檬黄色 n 二甲酚橙 n pH 6.3时呈 红色 ， n 二甲酚橙 +金属离子 =络合物呈 红色 。 n 因此，二甲酚橙只有在 pH 6的酸性溶液中可 作为金属离子的显色剂。如果在 pH 6的酸度下 进行光度测定，就会引入很大误差。 35 第十一章 吸光光度法 n (3)酸度对络合物组成和颜色的影响 n 对于某些逐级形成络合物的显色反应 、在不同的酸度时，生成不同络合比的络 合物，颜色也不同。例如铁与水杨酸的络 合反应，当 n pH 4 Fe3+(C7H4O3)2-+ 紫色 n 4 pH 9 Fe3+(C7H4O3)22- 红色 n pH 9 Fe3+(C7H4O3)32-3- 黄色 n 所以，显色反应中控制合适的酸度很 重要 36 第十一章 吸光光度法 n 3.时间和温度 n 时间： 显色反应的速度有快有慢。大多数 显色反应速度较慢，需要一定时间。但有些 有色化合物放置一段时间后，由于空气的氧 化，试剂的分解或挥发，光的照射等原因， 使颜色减退。适宜的显色时间和有色溶液稳 定程度，也必须通过实验来确定。实验方法 是配制一份显色溶液，从加入显色剂计算时 间、每隔几分钟测定一次吸光度，绘制 A-t曲 线，根据曲线来确定适宜的时间。 37 第十一章 吸光光度法 n 温度： 一般显色反应可在 室温 下完成。但是 有些 显色反应需要 加热 至一定的温度才能完成；也 有些 有色络合物在较 高温度下容易分解 。因此，应根据 不同的情况选择适当的温度进行显色。温度对光的 吸收及颜色的深浅也有一定的影响，故标样和试样 的显色温度应保持一样。合适显色温度也必须通过 实验确定 ,做 A-c曲线 即可求出。 n 4.有机溶剂和表面活性剂 n 溶剂对显色反应的影响表现在下列几方面： 38 第十一章 吸光光度法 n （ 1）有机溶剂降低络合物的离解度提高测定灵敏 度 n 如在 Fe(SCN)3溶液中加入可与水混溶的有机试剂 ( 如丙酮 )，由于降低了 Fe(SCN)3的离解度而使颜色加深 提高了测定的灵酸度。 n （ 2）有机溶剂影响显色反应的速度 n 例如，当用氯代磺酚 S测定 Nb时，在水溶液中显色 需几小时，如果加入丙酮后 ,仅需 30分钟。 n （ 3）表面活性剂 加入可以增加有色络合物溶解度 ，增加有色化合物的稳定性从而提高显色反应的灵敏 度。 39 第十一章 吸光光度法 n 5.共存离子的干扰及消除 n 共存离子存在时对光度测定的影响有以 下几种类型： n (1) 与显色剂生成有色络合物 。 n (2)干扰离子本身有颜色 。 n (3)与显色剂结合成无色络合物消耗大量显 色剂 而使被测离子络合不完全 。 n (4)共存阴离子与被测离子结合成离解度小 的另一化合物 而不与显色剂显色 。 40 第十一章 吸光光度法 n 消除干扰的方法主要有以下两种：消除干扰的方法主要有以下两种： n （ 1）控制酸度 n 利用各种离子与显色剂所形成络合物 稳定性差异，控制酸度 -就可以控制显色剂 R的浓度 -使某种金属离子显色另外一些金 属离子不能生成有色络合物。 n （ 2）加入掩蔽剂 n 掩蔽反应有络合反应也有氧化 还原反 应。 41 第十一章 吸光光度法 第四节 吸光度的测量及误差控制 一、测量波长和参比溶液的选择 1.测量波长的选择 必须选择溶液最大吸收波长的入射光，这样灵敏 度高。 如果最大波长处有干扰，应根据 “吸收最大，干 扰最小 ”原则，选用灵敏度稍低但能避免干扰的入 射光（见图 11-6）。 42 第十一章 吸光光度法 n 2. 参比溶液的选择 n n （ 1） 当试样、显色剂、其他试剂均无吸收时，可用蒸馏 水作参比液 n 。 n （ 2） 显色剂或其他试剂有吸收时，应选择试剂空白作参 比液 n 。 n （ 3） 试样中其他组分有吸收，显色剂无吸收且不与其他 组分作用时，应选择试样溶液做参比 二、比尔定律的偏离 43 第十一章 吸光光度法 三、吸光光度法的测量误差 n 光度分析法的误差来源有两方面： 1.化学因素 2.仪器测量误差 n （一）仪器测量误差 n 任何光度计都有一定的测量误差。 仪器测量误差主要 :光源的发光强度不稳定，光电效应的非线 性，单色器的质量差 (谱带过宽 )，比色皿的透光率不一致等 ，以上因素造成的测量误差的总和最后都表现为仪器的 T 。 n 对同一台光度计来说， T是定值， 一般 T =0.002-0.01之间 。 n 但固定的 T所造成的 C不是定值，是随 T的不同而不 同。 44 第十一章 吸光光度法 待测溶液的透光度很小或很大时，浓度测量误差都较 大； 透光度 T在 15%65% 之间，即吸光度 A在 0.20.8之间 ，才能保证测量的相对误差较小； 当透光度 T=36.8% 即 A=0.434时，测量的相对误差最小 。 45 第十一章 吸光光度法 n 2.吸光度范围的控制 n 控制吸光度 A在 0.2-0.80时，测量的准确度较 高。为此可以从下列几方面想办法： n （ 1）计算而且控制试样的称出量，含量高时， 少取样，或稀释试液；含量低时，可多取样，或萃 取富集。 n （ 2）如果已配成有色溶液，则可通过改变比色 皿的厚度来调节吸光度大小。 46 第十一章 吸光光度法 n 第五节第五节 吸光光度分析方法吸光光度分析方法 n 一、经典光度分析法 n （一）校准曲线法（标准曲线、工作曲线 ） 制作 A-c标准曲线 （二）示差法 当被测组分含量高时，常常偏离朗伯 -比耳定 律。即使不偏离，由于吸光度太大，也使 Er偏大 。如果采用示差法，就能克服这一缺点。 47 第十一章 吸光光度法 n 示差法与普通光度法的主要 区别 : n 采用的参比溶液不同，示差法不是以 c=0的 试剂空白作参比，而是以一个浓度比试液 cx稍 小的标准溶液 cs作参比，然后再测定试液的吸 光度。 48 第十一章 吸光光度法 n 以试剂空白为参比： n 标准溶液吸光度： As=-lgTs=bcs n 未知样吸光度： Ax=-lgTx=bcx n 以 cs为参比测得未知样吸光度为 Af n 实际 : Af=Ax-As=b(cx-cs)=bc n cx=cs+c 49 第十一章 吸光光度法 示差吸光光度法提高准确度的原因 在普通光度法中以空白液作参比，测得 Cs、