卷烟烟气中r-(+)-尼古丁形成机理的研究.docx

卷烟烟气中 R-(+)-尼古丁形成机理的研究 摘要 采用多维气相色谱法测定了烟草和烟气中尼古丁的 手性纯度。尽管在烟草中几乎检测不到右旋的尼古丁，但 在卷烟烟气中 R-(+)-尼古丁的相对比例达 2.6-3.6%。关于 烟气中 R-(+)-尼古丁的形成机理，文献中有两种理论假设， 但都没有用实验证实。在本研究中，为探索吸烟过程中 R- (+)-尼古丁的形成机理，采用微炉裂解器，对 S-(-)-尼古 丁和烟草样品进行热裂解，采用多维气相色谱法分析裂解 物中尼古丁的手性纯度。结果显示，无论是尼古丁化学品 还是烟草样品，S-(-)-尼古丁的消旋化与热裂解的进程高 度同步。另外，在 550。下，尽管纯 S-(-)-尼古丁试剂的 消旋化程度显著高于烟草中的 S-(-)-尼古丁，但是不同类 型烟草中的 S-(-)-尼古丁的消旋化程度非常接近。因此， 本研究为高温消旋化的假设提供了实验支持，即吸烟过程 中的高温是导致 S-(-)-尼古丁消旋化的主要动力。在一定 温度下，气态 S-(-)-尼古丁可逆地失去手性中心上的氢原 子，形成尼古丁自由基，重新与氢结合，形成外消旋尼古 丁混合物。多维气相色谱的预柱为 DB-1(30m0.25mm i.d ()25m)，手性柱为 DB-C：Cydodex-B(60m025mm id().25m)。FID 和 NPD 分别为监视检测器和分析 检测器。 关键词 尼古丁 消旋化 手性 热裂解 多维气相色谱 烟草 烟气 1 引言 尼古丁是烟草和烟气中含量最丰富的一个生物碱。尼 古丁是手性分子，手性中心是四氢吡咯环-2-位碳原子，所 以，尼古丁可以两个对映体存在：S-(-)-尼古丁和 R-(+)- 尼古丁。旋光对映体通常显示完全不同的代谢和生理特性， 所以，手性分析具有重要意义。一系列动物实验和体外细 胞试验显示，S-(-)-尼古丁的生理活性比 R-(+)-尼古丁更 强1毒性试验显示，S-(-)-尼古丁的毒性比 R-(+)-尼古 丁更强2天然烟草中的尼古丁主要是 S-(-)-构型，但是， 采用较灵敏和准确的手性分析方法，可在不同类型的烟草 原料中检测到 0.2-0.3%的 R-(+)-尼古丁(相对于总尼古丁 含量)3.在卷烟烟气中，R-(+)-尼古丁的相对比例大大高 于烟草4；根据最近的文献，在六个肯塔基参考卷烟主流 烟气中，R-(+)-尼古丁相埘比例为 3%左右2。关于卷烟烟 气中尼古丁的形成机理，Crooks 等人提出了两个假设5， 雷诺公司 Perfetti and Coleman 进行了相关研究2，6， 但是相关的机理仍然没有弄清楚7。 裂解气相色谱一质谱揭示烟气成分形成机理的重要研 究手段8-9。在本研究中，采用裂解和中心切割式手性多 维气相色谱(MDGC)10，对温度和尼古丁手性变化关系进 行了深入研究。另外，对烟草和烟气中尼古丁的手性组成 也进行了测定。 2 实验 2.1 试剂与材料 除非特别说明，所用试剂均为分析纯。外消旋尼古丁 标样(S-/R-，1/1)购自 Sigma Co(USA)商品卷炳购自当地 市场。烟叶原料取自上海烟草(集团)公司。 2.2 烟草萃取 称取 30 mg 烟末，加入 5 mL 乙酸乙酯和 1 mL10%NaOH，剧烈振荡充分混匀。离心，取上清液 1.0 mL 转移到 2 mL GC 样品瓶中，进行 MDGC 分析。 2.3 烟气分析 卷烟抽吸采用 IS03308 标准11，用 RM-XX0-孔道转盘 吸烟机(Borgwaldt Technik GmbH，Germany)。20 支卷烟的 主流烟气收集到 92 mm 直径的剑桥滤片上，然后用 20 mL 甲基叔丁基醚萃取，取 1 mL 萃取液转移到 2 mL 样品瓶中， 进行 MDGC 分析。 2.4 MDGC 条件 把 MDS 6890 多维附件(SGE，Australia)安装到 Agilent 6890 GC(Agilent Technology，USA)，构建 MDGC 系统。载气为高纯氦(99.999%)。预柱 DB-1,30m0.25mm i.d.0.25m 膜厚(Agilent， USA).手性柱 DB- Cyclodex-B，60m0.25mm i.d.0.25m 膜厚(Agilent Technologies,USA)手性固定相是 10.5%全甲基化 -环 糊精分散到 DB-170114%(cyanopropylphenyl) methylpolysiloxane中。预柱和分析柱的载气流速分别为 1.9 and 2.7 mL/min。一维色谱的柱温程序：初温 100， 升温到 200，速率 8/min，保持 5 min。尼古丁的一维 保留时间为 9.0 min，所以中心切割范围选择 8.8 到 9.2 min。液态 C0，为冷却剂，打开时间为 7 min，关闭时间为 13 min。手性分离的炉温程序：初温 50，升温至 130， 速率 0.5/min，然后以 10/min 升温到 180，保持 5 min，一维色谱检测器为 FID，FID 温度 250，氢气流速 40 mL/ min，空气流速 350 mL/min，补充气(氦气)流速 30 mL/min。手性柱检测器为 NPD，NPD 温度 320，氢气流速 2 mL/min，空气流速 60 mL/min，补充气(氦气)流速 10 mL/min，铷珠电压 3.80V。分流/不分流进样口温度 250 0C，进样量 30L，分流流量 30 mL/min。 2.5 裂解买验 2.5.1 裂解-MDGC 微炉裂解器(Pvroiector II，SGE，Australia)直接与 MDGC 联用。裂解温度范围为 300-700，温度间隔为 50。 载气为氦气，压力比气相色谱进样口高出 5 psi。溶液样品 采用 SGE 液体进样针(70 mm 针头)将 1 uL S-(-)-尼古丁溶 液(戊烷中，1.0mg/mL)注入裂解器。烟末样品采用 SGE 螺 旋进样针进样，但是气相色谱分流流量由 30 mL/ min 增加 到 200 mL/min，目的是防止尼古丁响应信号太高而影响手 性分离效果。 2.5.2 裂解-GC/MS SGE 螺旋针头进样器的进样量重复性有一定局限，为了 更准确地获得烟草裂解产物中尼古丁的峰面积，改用 SGE pelletizer 固体进样器，精确称取 1.0 mg 烟末注人裂解- GC/MS，考虑到烟草裂解产物组成复杂，采用质谱-萃取离 子(m/z84)计算尼古丁的峰面积。 GC/MS 分析条件：毛细管色谱柱 DB-1，30m0.25mm i.d.0.259m 膜厚(Agilent，USA)，载气为氦气，恒流 流速 1.0 mL/min，分流流量 100 mL/min炉温从 40(保 持 2.0 min)升至 280(4/min)(保持 5 min)。MSD 扫描 范围 33-350 D。MS 接口、离子源和四极杆温度分别为 280，230 and 150。 3 结果与讨论 3.1 尼古丁对映体的手性分离 烟草和烟气中尼古丁的手性分离具有一定难度，目前 仅少量几种测试方法报道4，包括 1H- NMR，手性 HPLC 和 手性 GC/MSD-SIM4。1H- NMR 和手性 HPLC 一般需要复杂 的样品纯化手续，步骤多，耗时长。本文 MDGC 方法是在 Perfeni and Coleman 的手性 GC/MS-SIM 方法2的基础上 发展起来的。主要的技术改进是，首先，考虑到烟草和烟 气的复杂性，采用二维气相色谱取代一维色谱，有效消除 基质干扰。其次，对手性色谱柱进行了重新选择，用一根 DB-Cyclodex-B column(60 m 0.25 mmi.d.0.25 m 膜 厚柱取代文献中的串联色谱柱。本研究发现，一根 60 米的 DB-Cyclodex-B 手性色谱柱对尼古丁的手性分离能力，远远 优于文献中的串连手性柱(DB- Cyclodex-B 柱与 Rt- DEXsm 柱相连，规格均为 30m 0.25 mm i.d.0.25m 膜厚)2. 尼古丁外消旋混合物手性分离的色谱图见图 1。尼古丁 对映体达到基线分离，为手性组成的准确定量奠定了基础。 3.2 尼古丁手性组成的检测限 尼古丁手性组成通常以 R-(+)-尼古丁占总尼古丁的百 分比来表示。为衡量检测限，理想的办法是在纯 S-(-)-尼 古丁中添加右旋对映体。但遗憾的是，商品 s-(-)-尼古丁 试剂中通常含有微量的右旋对映体杂质，右旋对映体含量 一般为 0.2-0.9%3。在本研究中，我们也在一个 s-(-)- 尼古丁试剂中检测到约 1%的右旋杂质。比较而言，天然烟 草中 R-(+)-尼古丁含量反而更低一些，一般只有 0.2- 0.3%3。因此，在本研究中，为了评估对 R-(+)-尼古丁的 检测能力，我们把一定量尼古丁外消旋混合标样加入烤烟 萃取物(在该烤烟萃取物中检测不到 R-(+)-尼古丁)，结果 表明，当 R-(+)-尼古丁的加入量达到 0.2%(相对于总尼古 丁含量)时，就可观察到 R-(+)-尼古丁的响应信号。假定该 烟草样品中 R-(+)-尼古丁相对含量为 0.3%，那么本方法对 R-(+)-尼古丁的检测限约为 0.5%。国外文献中 R-(+)-尼古 丁的检测限约为 2.0%2，说明本方法的灵敏度显著提高。 3.3 烟草和烟气中尼古丁手性组成研究 共测定了 20 个烟草样品，包括 12 个烟叶原料和 8 个 卷烟烟丝样品。仅在 2 个香料烟和 1 个烤烟中发现了 R-(+) -尼古丁的信号，其中 1 个香料烟的色谱图见图 2，其中 R- (+)-尼古丁相对含量约 0.5%。这个结果也表明，天然烟草 中尼古丁绝大部分是以左旋形式存在的。 测定了 8 个成品卷烟的主流烟气，其中一个烟气的色 谱图见图 2。与烟草相比，卷烟烟气中 R-(+)-尼古丁相对 含量显著增加。采用色谱工作站自动积分(基线到基线模式)， 定量结果见表 1。卷烟主流烟气中 R-(+)-尼古丁的相对含 量范围是 2.6 t0 3.6%，本结果与文献中六种肯塔基参考卷 烟主流烟气的测定结果较为接近2。 3.4 S-(-)-nicotine 试剂的热消旋化和热分解过程考 察 在不同裂解温度下，裂解一手性 MDGC 色谱图如图 3 所 示。R-(+)-尼古丁相对含量随温度的上升而增加，尼古丁 峰而积则随着温度的上升而减少。 裂解温度对尼古丁旋光组成和色谱峰面积的影响分别 如图 4 和图 5 所示。在温度为 300-400时，尼古丁相对稳 定，同时 R-(+)-尼古丁的相对比例随温度的上升而略有增 加。从 450-550，尼古丁热分解开始加速，同时 R-(+)- 尼古丁的相对比例也迅速增加。当温度达到 550时，R-(+)- 尼古丁的比例达到 21.8%。裂解温度达到 600，裂解产物 中几乎检测不到尼古丁。比较图 4 和图 5，可以发现，S-(-)- 尼古丁热消旋化曲线和热分解曲线几乎是对称的。 因此，对 s-(-)-尼古丁试剂来说，热消旋化与热裂解 的过程具有高度的同步性。 3.5 烟草中 S-(-)-尼古丁的热消旋化和热分解过程考 察 根据 pelletizer 固体进样和 GC/MS-总离子流萃取离子 (m/z84)峰面积数据，烟草裂解温度对尼古丁峰面积的影响 规律见图 6。该烟末来自表 1 中的第 5 号卷烟。烟草裂解温 度对尼古丁手性组成的影响见图 7。比较图 6 和图 7，可以 发现，烟草中的尼古丁比纯化学试剂更加稳定，在 300- 500温度范围内，尼古丁分解不明现，同时烟草裂解产物 中 R-(+)-尼古丁的相对比例仅略微增加。在 550-600范 围内，烟草中尼古丁的热分解进程突然加快，同时，R-(+) -nicotine 比例也突然增加。在 550 and 600下，R-(+)- 尼古丁相对比例分别达到 15.7%和 25.9%。当温度升高到 650，手性 MDGC 几乎检测不到尼古丁，GC/MS 总离子流色 谱中尼古丁的信号也较小。当温度升高到 700，尼古丁色 谱峰消失。图 6 和图 7 中两个曲线也几乎是对称的。 烟草裂解分析结果也显示，烟草中尼古丁的热分解和 s-(-)-尼古丁的消旋化过程也存在高度的同步性。 烟草中尼古丁一般是以有机酸盐的形式存在的，所以 显示出更好的热稳定性能。但是，一旦温度超过 500，有 机酸烟碱盐分解，尼古丁的热裂解进程迅速加快。 在本研究中，对不同类型的烟草材料进行了裂解和手 性 MDGC 分析，其中 550的测定结果见表 2。在相同的裂 解温度下，尽管纯 S-(-)-尼古丁试剂的消旋化程度显著高 于烟草中的 s-(-)-尼古丁，但不同类型烟草中的 S-(-)-尼 古丁的消旋化程度非常接近。这也说明，温度是烟草中 S- (-)-尼古丁发生消旋化的主要动力。3.6 卷烟烟气中 R-(+) -尼古丁的机理关于卷烟烟气中 R-(+)-尼古丁的形成机理， Crooks 等人5提出了两种理论假设，第一个假说认为，在 卷烟燃烧的高温下，烟草中 S-(-)-尼古丁消旋化形成 R-(+)- 尼古丁并转移到烟气中。第二个假说认为，卷烟烟气气溶 胶存在大量的甲基自由基，与烟叶中的 R-(+)-降烟碱结合， 形成了 R-(+)-尼古丁。 为了证实第二个假说，Perfetti and Coleman6做了 实验探索。通过烟草外的加入方式，即把 s-或 R-降烟碱加 入参比卷烟，结果主流烟气中 R-(+)-尼古丁相对比例不变。 还通过烟草内部的添加方式，即把 S-(-)-降烟碱含量很高 的烟叶加入配方，结果主流烟气中 R-(+)-尼古丁相对比例 也没有变化。以上结果说明，第二个机理可能是不存在的。 本研究的目的是证实第一个机理。根具本实验的结果， 无论 S-(-)-尼古丁是纯试剂状态还是存在于烟草中，消旋 化和热分解的发生过程都具有高度的同步性。换句话说。 温度是 S-(-)-尼古丁消旋化的主要动力。所以，本研究提 供的证据支持第一个机理。具体的反应机理可用图 8 来说 明，在高温下，气态 S-(-)-尼古丁分子可逆地失去手性中 心上的氢原子，形成尼古丁自由基，在重新与氢结合的过 程中，形成 R-(+)-尼古丁。 根据我们有限的知识，这是国内外首次利用实验证实 烟气 R-(+)-尼古丁的形成机理。 根据 Baker 的描述12，卷烟燃烧锥温度为 700-950， 紧接燃烧锥的是裂解-蒸馏区，温度为 200-600，大部分 烟气气溶胶是在裂解蒸馏区形成的。根据本研究，烟草 S- (-)-尼古丁的热裂解和消旋化的发生温度为 550-600，也 在卷烟的裂解-蒸馏区。从这一点来说，热裂解的确是研究 卷烟烟气成分形成机理的一个强有力的分析手段。 但是也应指出，采用热裂解手段，烟草 S-(-)-尼古丁 的消旋化程度被显著夸大了。在卷烟烟气中，R-(+)-尼古 丁的相对比例仅 3%左右。但在烟草裂解产物中，在 550， 时，R-(+)-尼古丁的相对比例为 15.7%；在 600下，R-(+)- 尼古丁的相对比例达到 25.9%，都大大高于烟气中 R-(+)- 尼古丁的相对比例。大量文献表明，在模拟卷烟燃吸过程 方面，管式裂解炉通常夸大了烟草化学成分的裂解程度。 本研究从 S-(-)-尼古丁的消旋化角度，也说明了这一点。 为了更贴切地模拟卷烟燃烧过程，Baker and Bishop2采 用热丝裂解器并设定温度程序，可较好的解决了管式炉的 过度裂解问题。但是，我们认为，热丝裂解器可能会过低 估计烟草化学成分的裂解程度。热丝裂解器的进样温度为 250-300，尼古丁是半挥发物，大部分尼古丁可能未来得 及进行高温裂解，就已经从烟草中脱附并进入色谱仪。在 今后的研究中，我们将应用热丝裂解方式，并与管式炉的 裂解分析结果进行比较。所以，本研究对今后烟气成分形 成机理和更合适裂解条件的探索，也具有重要的指导价值。 参考文献 1 P. J. Jacob, and G. D. Byrd, In: J. W. Gorrod, J. Pevton (Eds.), Analytical determination of nicotine and related compounds and their metabolites, Elsevier, Amsterdam, 1999, p191. 2 T. A. Perfetti , W. M. Coleman , Beitr. Tabakforsch.Int. 18 (1998) 15. 3 D. W. Armstrong, X. Wang, Chirality 10 (1998) 587. 4 K. Rustemeier and lean-Jacques Piad , In : J. W. Gorrod, J. Peyton (Eds.), Analytical determination of nicotine and related compounds and their metabolites, ElSevi