2010级生物工程一班李晓萌——生物工程下游技术论文

关于金属螯合亲和层析的研究与现状 李晓萌 2010 级生物工程一班 摘要 本文介绍了固定化金属螯合亲和层析(IMAC)技术的一些研究成果和发展 现状，IMAC 的应用，最后介绍了 IMAC 的最新应用及理论模型研究进展。 关键词 固定化离子亲和层析；应用研究；发展现状。 金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography ,IMAC) ,是近20 年发展起来的一项新型分离技术。 Porath 首先将Cu2 + 、Zn2 + 通过螯合剂亚氨基二乙酸( Iminodiacetate , 1 IDA) 交联到 agarose 分离蛋白质。该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸,例如 组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理,从而对 蛋白质加以分离。由于IMAC 具有螯合介质制备简单方便,吸附容量大,选择性及 通用性较好,易于再生,成本低等优点,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品 最有效的技术之一。而且该项技术原理在其他领域的应用研究也日益引起人们 的注意。近来的研究表明IMAC不仅可以用于蛋白质或多肽的分离纯化，也能用 于寡核苷酸的分离 、病毒的灭活 以及从蛋白制备物中去除内毒素 等。本2 3 4 文将就IMAC 基质研究及应用现状的最新进展作一综述。 原理 过度金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩 余的空轨道是电子供体的配位点，在溶液中被水分子或阴离子占据。当蛋白质 表面氨基酸残基与金属离子的结合力比它们更强时，则蛋白质取代它们金属离 子形成复合物，从而使生物分子被吸附。根据软硬酸碱理论，Cu 、Fe 、Co23 、Zn 、Ni 等为交界酸，易与组氨酸、色氨酸上的交界碱氧原子和半胱氨22 酸上软碱硫原子配位结合，而Ca 、Mg 等硬酸则易与磷酰化氨基酸上的硬碱2 磷原子配位结合。由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象 不同，因而与金属螯和物的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。 基质 理想的基质(载体、固定相)应具有高度特异性(表面电荷总量接近为零)、高 度亲水性(无疏水作用位点)、足够多可利用的化学基团、适当的表面积和孔径、 较高的理化稳定性等特点。一般情况下，决定亲和吸附总效率的主要因素是基 质的特异性、吸附容量和稳定性，这三个因素的相对重要性依纯化的目的和规 模不同而异。 琼脂糖是最常用的基质材料，还有纤维素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚 羟乙基甲基丙烯酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸环氧烷、树脂及上述物质的 衍生物和共聚物，此外还有大孔硅胶、多孔玻璃、磷灰石等无机材料 。近年5 来，又出现了以超滤膜或微滤膜为基质的固定化金属螯合亲和膜；最近有报导 称用固定化合成多肽的方法制成了生物特异性基质 。6 应用研究 1、金属螯合亲和层析用于生物分离纯化 IMAC在生物分子纯化方面具有很多优点：(1)结合力强，蛋白结合容量大， 可用于工业生产，如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附（EBA)技术可从哺乳动物 细胞培养粗提物中一步分离纯化溶解性目标蛋白；(2)洗脱条件温和，再生后配 体恢复完全，一种IMAC树脂可再生几百次而不改变其层析特性；(3)价格便宜； (4)可通过改装各种金属离子，引入目标蛋白质最适宜的金属离子进行不同蛋白 质的纯化。 固定化金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸附 蛋白质的分离系统。目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基, 如组氨酸的咪 唑基, 半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基, 十分有利于蛋白质与固定化金属离 子结合, 这是IMAC 用于蛋白质分离纯化的根据 。金属离子如锌和铜, 已发87 现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。文献 利用金属螯合亲9 和层析纯化和复性重组人铜锌超氧化物歧化酶( SOD) 。文献 用金属螯合亲10 和层析纯化了玉米SOD。 目前，基因工程重组蛋白纯化技术已经成熟，常通过DNA重组技术对蛋白进 行标记，该方法在重组蛋白质表达过程中巧妙地将标签(常为6His尾巴)直接 连接到蛋白质的N一末端或C一末端，这种基因工程蛋白与裂解液中的其他蛋白 质相比，对金属离子有更高的特异性，在分离纯化后再用化学法或酶法将尾巴 切掉。这种方法目前已经成为基因工程下游技术中对融合蛋白纯化最常用的方 法。国外公司已推出商品化试剂盒，美国Qiagen公司提供的QIAexpress系统就 是较为经典的一种。该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强 启动子和多克隆位点等组成，可将目的基因在宿主细胞中高效表达。表达后的 产物可直接用金属螯合亲和层析进行分离，有时可实现一步纯化。金属螯合亲 和层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化，还可以用于变性条件下 (6molL盐酸胍或8molL尿素)纯化，这对以包涵体形式存在的重组蛋白尤为 有利。 2、金属离子转移 在应用IMAC 技术分离蛋白质的过程中,由于某些蛋白质具有捕获金属离子的 能力,会发生金属离子转移(MIT) 现象,可导致蛋白质收率降低 。在这种12 情况下,从螯合树脂上脱附的金属离子将会污染终产物,泄露至产物中的金属离 子可作为氧化反应的催化剂,损害了蛋白质的稳定性;如果纯化的蛋白质用于治 疗目的,更是一个严重问题。对这一问题的解决办法除了根据蛋白结构选择合适 的金属离子 ,以确保蛋白质分子的稳定之外,一般在IMAC 之后的纯化过程12 可以确保产物中不含金属离子,如通过使用填充强螯合剂(如TED) 且不负载金属 离子的层析柱,就可以从蛋白质上除去不需要的金属离子 ;当然还可以直接使13 用具有对金属有强螯合作用的树脂来解决这一问题。 3、其他领域的应用 IMAC 与重组DNA 技术相结合可以使带有组氨酸尾的重组蛋白定向固定在基 质上,这样就为研究蛋白质的结构和受体- 配体的相互作用开辟了新的途径。比 如Celia 等 用Ni 负载的金属螯合脂质定向膜捕获组氨酸标记的MHC 分子,142 再通过表面等离子体共振技术(Surface pasmon resonance) 考察它们对T 细胞 受体的结合。锚定蛋白质的NTA/ 组氨酸标记体系也可被用来通过原子力显微镜 测量受体- 配体在单分子水平上的结合力 。15 在固定化酶研究方面，受IMAC的启发，蛋白质的某些结构域可以“位点特异” 的固定在固相载体表面，比随机位点固定增加了被固定蛋白质的稳定性并较好 的保持了其空间结构，比如固定化酶时可提高酶的半寿期，多次重复使用酶活 力亦无明显损失。 发展现状 IMAC技术的最大优点在于利用它对粗提液进行一次简单的处理便可得到所需 的高纯度的活性物质, 该技术不但能用来分离一些在生物材料中含量极微的物 质, 而且可以分离那些性质十分相似的生化物质。但IMAC也有一些缺点, 主要 是载体( 如琼脂糖) 价格昂贵, 机械强度低; 配基制备困难,有的配基本身需要 分离纯化; 配基与载体偶联条件苛刻等。 IMAC仍在不断发展和演变，人们将IMAC与其他分离方法有机结合起来，扬长 避短，使其分离的能力与效果大大增强。尽管目前仍有一些技术问题需要研究 和解决，但相信IMAC必将成为生物大分子分离纯化的有力工具。 参考文献 1 Porath J , Carlsson J , Olsson I , etal . Metal Chelate affinity chromatography: A new approach to protein fractionation J .Nature ,1975 ,258 ,598 599 2 Min C，et a1Nucleic Acids Res，2006，24：38063810 3 Roberts PL，et a1Vox Sang，1994，67(Supp1)：169171 4 Franken KLMC，et a1Protein Expr Purif，2000，18：9599 5 Kim.D.H. et al.,Biotechnol.Progrem.,11(1995) 6 Poroth et al.，Acedemic Press Int.,N.Y.,1983,173 7 Lopatin S, Varlamov V. Appl Biochem Microbiol J ,1995, 31: 221. 8 Porath J. Protein Expr Purif J , 1992, 3: 263. 9 刘建荣, 刘建国, 赵晓瑜, 等. 生物工程学报 J , 2005,21( 6) : 993. 10 刘剑利, 孟鑫, 张强, 等. 粮食与饲料工业 J , 2005,10: 25. 11 Porath J . . Immobilized metal ion affinity chromatographyJ . Protein Expr. Purif . , 1992 ,3 :263 - 281 12 Sulkowski E. . The saga of IMAC and MITJ . Bioessays ,1989 ,10 :170 175 13 Chaga G. S. . Twenty - five years of immobilized metal ionaffinity chromatography : past , present and future J . J .Biochem. Biophys. Methods. , 2001 , 49 :313 - 334 14 Celia H. , Wilson - Kubalek E. , Milligan R. A. , etal .Structure and function of a membrane - bound murine MHC class I moleculeJ . Proc. Natl . Acad. Sci . USA , 1999