cmh毕业论文终稿

目 录 摘 要 .III 关键词 .III Abstract.III Key words .III 英文缩略词表 IV 1 前言 1 1.1 口蹄疫的基本特征 .1 1.1.1 口蹄疫病毒基本概念 1 1.1.2 口蹄疫病毒生物学特征 1 1.1.3 口蹄疫病毒危害 1 1.2 泛素蛋白及其对抗原的影响 .2 1.3 siRNA 干扰机制 3 1.4 干扰素与口蹄疫免疫 4 1.5 FMD 疫苗研究进展 .5 1.6 本实验研究的目的与意义 .6 2 实验材料 6 2.1 菌种、毒株、载体与质粒 .6 2.2 主要药品与试剂 .6 2.3 主要培养基及配制 .7 2.4 缓冲液及其配制 .7 2.5 其他溶液 .7 2.5 空斑筛选与纯化相关试剂 .8 2.6 寡核苷酸引物 .8 3 实验方法 8 3.1 转移载体 PIECMVUbiP1P1SiFIFN 的构建策略 .8 3.1.1 限制性内切酶酶切反应 9 3.1.2 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测 9 3.1.3 酶切产物的回收 9 3.1.4 回收产物的去磷酸化反应 9 3.1.5 目的基因与载体的酶连反应 9 3.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化 10 3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） 10 3.2.2 质粒的转化 10 3.2.3 质粒的小量制备（OMEGA 试剂盒） 10 3.2.4 质粒的大量制备（OMEGA 试剂盒） 11 3.2.5 阳性质粒的酶切鉴定 11 3.3 以 PRV 为载体表达 FMDV 抗原蛋白基因 P1，泛素蛋白与抗原 P1 的融合基因 Ubi- P1，RNA 干扰基因 shRNA，干扰素基因 IFN- 的重组病毒的构建 12 3.3.1 细胞的培养、冻存与复苏 12 3.3.2 PRV TK-/gE-/LacZ+基因组 DNA 的提取 12 3.3.3 脂质体介导的共转染 13 3.3.4 重组病毒空斑纯化和 PCR 鉴定 13 华中农业大学 2011 届本科毕业论文 II 3.3.5 鉴定用 PCR 模板处理 14 3.3.6 重组病毒 PCR 鉴定 14 4 结果与分析 15 4.1 转移质粒 PIECMVUbiP1 的构建 .15 4.2 转移质粒 PIECMVUbiP1P1 的构建 .15 4.3 转移质粒 PIECMVUbiP1P1SiFIFN 的构建 .16 4.4 共转染产物接毒第三代 PCR 鉴定 .17 4.5 重组病毒的空斑纯化及 PCR 鉴定 .18 4.5.1 空斑的形成 18 4.5.2 在 PK-15 细胞上的第一轮空斑筛选 .19 4.5.3 在 Vero 细胞上的第一轮空斑筛选 20 4.5.4 重组病毒的空斑筛选结果 .20 5 讨论 20 5.1 载体的构建 20 5.2 细胞的传代培养 21 5.3 空斑筛选实验 21 5.3.1 空斑筛选细胞的选择 .21 5.3.2 RNA 干扰对空斑筛选结果的影响 22 5.3.3 干扰素 对空斑筛选结果的影响 22 参考文献： .22 致 谢 .24 猪 O 型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 III 猪 O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 The construction of recombinat Virus for Generating a Novel Genetic Engineering Vaccine Agansit O Type FMDV of Pig 摘 要 口蹄疫是一种急性、高度传染性的病毒性传染病，虽自 20 世纪初口蹄疫疫苗 已经在世界部分地区应用，但目前全球口蹄疫疫情依然严重，也构成了世界动物及 动物产品贸易的障碍。由本实验室构建的猪伪狂犬病毒基因缺失株 PRV TK-/gE- /LacZ+作为一种病毒载体，具有安全性好、容量大、重组效率高等优点，本研究用 人工合成的 O 型口蹄疫 P1 基因作为抗原基因，用和泛素（Ub ）融合的 UbiP1 作为 另一个抗原基因同时达到增强细胞免疫效果，再将针对口蹄疫 3B 基因设计的 shRNA 和具有抗病毒及免疫调节效果的猪 IFN- 与以上两个功能基因串联，构建了 具有四个功能基因的转移载体，将此转移载体和 PRV 缺失株 TK-/gE-/LacZ+共转染 细胞，发生基因重组后进行了空斑纯化，经鉴定，初步得到了含有 P1 基因、 UbiP1、shRNA、IFN- 四个功能基因的重组伪狂犬病毒，为进一步构建新型基因 工程疫苗打下基础。 关键词：抗原基因；泛素蛋白基因；干扰素基因；重组病毒 Abstract Foot and mouth disease (FMD) is an acute, highly contagious virul infection disease. Although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the disease still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce of animals and animal products. The vector virus PRV TK-/gE-/LacZ+ , constructed by our laboratory , has the advantages of safety, high capacity, high restructuring efficiency. This study we selecte synthetic O type FMDV P1 gene as antigen gene, P1 and ubiquitin (Ub) fusion gene UbiP1 as another antigen gene to enhance cellular immune effect. Then use shRNA designed for 3B gene of FMD, IFN- gene of porcine has anti-viral and immunomodulatory effects tandem with the above two function gene, constructed transfer vector with four functional gene. Making the transfer vector and the PRVTK-/gE-/LacZ+ cotransfected in cells. After the occurrence of recombinant, plaques were purified, identified, initially received recombinant pseudorabies virus with four functional genes of P1 gene, UbiP1, shRNA and IFN-, in order to further build a new foundation for the construction of genetic engineering vaccine. 华中农业大学 2011 届本科毕业论文 IV Key words：antigen gene; ubiquitin; interferon gene; recombinant virus 英文缩略词表 Abbreviation 缩写 英文名称 中文名称 FMD FMDV Ub UPS RNAi siRNA shRNA SIF IFN PRV NCS Amp DMEM LB PBS PCR SDS EB OD EDTA PK Vero DMSO MEM Foot-and-month disease Foot-and-Mouth disease virus Ubiquitin Ubiquitin-proteasome system RNA interference RNA interference gene RNA interference gene Interference gene fragment -interferon gene Pseudorabies virus Newborn calf serum Amplicillum Dulbeccos Modified Eagle Medium Luria-Bertani medium Phosphate buffer solution Polymerase chain reaction Sodium dodecylsulphate Ethidium bromide Optical density EDTA Disodium Salt Pig kidney cells African green monkey kidney cells Dimethyl sulfoxide Minimal Essential Medium 口蹄疫 口蹄疫病毒 泛素 泛素蛋白酶系统 小 RNA 干扰 小 RNA 干扰基因 小 RNA 干扰基因 干扰基因区段 干扰素基因 伪狂犬病病毒 新生牛血清 氨苄青霉素 改良 Eagle 培养基 LB 培养基 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 十二烷基磺酸钠 溴化乙锭 光密度 乙 二 胺 四 乙 酸 猪肾细胞 非洲绿猴肾细胞 二甲基亚砜 微小型培养基 猪 O 型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 1 1前言 1.1口蹄疫的基本特征 1.1.1 口蹄疫病毒基本概念 口蹄疫(Foot-and-month disease, FMD)是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus, FMDV）感染引起的人畜共患的急性、烈性传染病，该病全世界分布广泛， 主要感染偶蹄类，一旦爆发常造成巨大的经济损失。由于存在制作灭活苗灭活不彻 底和毒力返强造成的潜在危险，开发新型基因工程疫苗已引起人们的重视。 1.1.2 口蹄疫病毒生物学特征 口蹄疫病毒呈球形，正二十面体结构，直径20-25nm;无囊膜，对酸碱敏感，口 蹄疫病毒粒子由衣壳和病毒核酸构成，衣壳由60个不对称的亚单位组成，每个亚单 位含一分子的VP1、VP2 、 VP3和VP4，其中VP4位于病毒颗粒内部。FMDV属于小 RNA病毒科，口蹄疫病毒属，有7个血清型，即O ，A ，C，SAT 1, SAT 2, SAT 3和 Asia 型(Rodriguez and Grubman, 2009)，各个血清型间无交叉反应（陆承平等， 2005） ，病毒的这种特性，给其检疫、防疫带来极大的困难。 FMDV 基因组为具有感染性的单股正链 RNA，大小约 8.5kb，只有一个开放的 读码框(open reading frame, ORF)，两侧各有一个非编码区(non coding region, NCR)。 开放读码框首先翻译为一个多聚蛋白，经过蛋白酶切割为成熟的结构和非结构蛋白 以及一些中间体。FMDV 基因组 P1 区编码结构蛋白，P12A 前体物在 3C 蛋白酶作 用下形成由 VP4-VP2，VP3 和 VP1 组成的原体。 5 个原体组成一个五聚体，十二 个五聚体组装成包含 RNA 的前病毒粒子或者缺乏 RNA 的空衣壳。在感染细胞中， FMDV 3C 蛋白酶基因编码的蛋白能催化加工 P12A 前体衣壳蛋白为 VP0、VP1、VP3 ，这三种蛋白能相互作用形成 5S 原体，成为病毒粒子结构的组件， 形成病毒样颗粒，这种没有病毒核酸的病毒样颗粒具有与全病毒相同的免疫原性。 1.1.3 口蹄疫病毒危害 FMDV主要感染偶蹄类物种如猪、牛、绵羊、山羊、水牛等，许多野生偶蹄类 物种也可能容易受到感染，其中骆驼被证明对口蹄疫是易感的(Larska et al, 2009)。 因感染口蹄疫而患病动物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位发生水泡，破溃、形成烂 斑。口蹄疫发病率几乎达100%，该病一旦暴发，能迅速演变为生物灾害，直接受 到重大甚至于毁灭性打击的是畜牧业及其相关产业。为了控制病情的蔓延，一般采 取的措施是直接将大批动物扑杀销毁，这样的措施不仅不能从根本上解决疫情往往 还会引发严重的公共卫生问题，造成社会的恐慌。口蹄疫爆发的破坏力还会波及到 华中农业大学 2011 届本科毕业论文 2 其它行业，如对外出口被迫关闭，疫区被严密封锁，旅游受阻等，如去年4月份韩 国爆发的FMD呈全国蔓延状态，让韩国防疫当局进入紧急状态。根据口蹄疫的危 害程度，世界动物卫生组织将口蹄疫列为A类动物传染病，我国农业部将口蹄疫列 为一类动物疫病，将口蹄疫病毒列为一类动物病原微生物。 1.2泛素蛋白及其对抗原的影响 图 1：泛素- 蛋白酶体系统图解（Smalle and Vierstra, 2004） Fig.1:Schematic of the ubiquitin-proteasome system 泛素(Ubiquitin, Ub)是一个由 76 个氨基酸组成的高度保守的多肽链，泛素化过 程是一个复杂的，并受到高度调控的过程，由三个级联反应组成，需要三类酶参与 催化。这三类酶分别被称为 E1泛素激活酶，E2 一泛素耦联酶，E3 一泛素连接酶。 整个过程大致如下：首先在 ATP 的参与下，在 E1 的半胱氨酸活性位点与泛素 C 末端的甘氨酸形成硫酯键(Ciechanover et al., 1981; Hershko et al., 1981)；接着，连接 在 E1 的泛素被转移到 E2 的活化半胱氨酸位点；最后，在 E3 的催化下，泛素 C 末 端与底物的某个位点的赖氨酸结合(Ciechanover, 1993; Weissman, 2001)。当第一个 泛素分子连接到靶蛋白上后,另外一些泛素分子在 E3 的催化下相继与底物相连的泛 素分子的第 46 位赖氨酸残基相连,形成一条多聚泛素链，作为底物被蛋白酶体识别 和降解的靶向性信号(Ii Ito et al., 1997)，一旦靶蛋白被 4 个以上的泛素分子修饰,它 们就被蛋白酶体降解。完成泛素化的蛋白质结构被展平进入 26S 蛋白酶体，经过它 的处理，蛋白质就被切成由 7 至 9 个氨基酸组成的短链，泛素分子可被水解下来, 重复利用(Groll et al., 1997; Davies 2001; Smalle and Vierstra, 2004)。泛素系统广泛参 与了多种基本的细胞过程并由此引起了特别的关注(Huang et al., 1995)，其中泛素- 蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway)是一个新近受到关注的调节蛋白质降解 与功能的重要系统(Pickart and Eddins, 2004)。这是真核细胞内除溶酶体外的另一种 非常重要的蛋白降解系统，也是调节各种细胞生物学过程的重要机制，为人们提供 猪 O 型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 3 了一个增强抗病毒效果的新思路。 1.3 siRNA干扰机制 图 2：RNA 干扰现象的机理（ Provenzano and Mocellin, 2004） Fig.2: The mechanism of RNA interference RNA 干扰（RNAi）是一个基因表达的沉默机制，细胞内的复合酶切割双链 RNA（ dsRNA）分子为 21-25 个核苷酸的长度，这些短干扰 RNA（RNAi ）引导 RNA 干扰，诱导沉默复合体（RISC ）去剪切与干扰 RNA 序列互补的 mRNA(Fire et al., 1998; Sharp, 2001; Hannon, 2002; McManus, 2004)，转录受抑制或翻译受到抑 制，从而在转录水平或转录后水平干扰基因表达(如图 2)。 1998 年 Fire 等首次把双链 RNA(dsRNA)注射入一种线虫 （caenorhabditiselegans） 体内，dsRNA 使互补的 mRNA 降解，诱导了靶向性的基 因表达沉默(genesilencing), 这一现象称为 RNA 干扰（RNA interference，RNAi） 。同 植物中的共抑制(co suppression)或转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS） 、真菌中的基因表达压抑（quelling）一样，RNAi 也是一种典型 的转录后基因表达调控方式，是美国Science和 Nature 评出的 2002 年度最 重要的科技成果之一，这成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。康奈尔大学的 Guo 等利用反义 RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans) 中的 par1 基因的表达以期得到与对照组注射正义 RNA(sense RNA)相反的结果，但 最终的结果却令他们费解:二者同样阻断了 par1 基因的表达途径。直到 1998 年， Fire 等的研究结果证明，在正义 RNA 也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的 华中农业大学 2011 届本科毕业论文 4 是双链 RNA，这些双链 RNA 是体外转录正义 RNA 时生成的，这种双链 RNA 对 基因表达的阻断作用被称为 RNAi。随后的研究结果发现， RNAi 现象在从植物到 人类的多种生物中存在(McManus, 2004)。生物体可利用 RNAi 来抵御病毒的感染， 阻断转座子的作用。RNAi 属于转录后基因沉默机制，其本质是 siRNA 高效、特异 地阻断体内同源基因表达，致使 mRNA 降解和基因表达受抑。自然界中， RNAi 可 能是动植物体内的一种保护机制，主要作用在于防御病毒感染，维持基因组中转座 子的稳定，参与胚胎发育等。有实验表明，添加外源合成的 siRNA 分子到哺乳动 物细胞能诱导 RNA 干扰(Elbashir et al., 2001)，此后诱导参与基因遗传中或后天失 调的信使 RNA 降解的 RNA 干扰疗法便迅速发展起来，同时有研究证明 RNAi 技术 有很多非常适合作为抗病毒治疗的原因(Leonard and Schaffer, 2006)，所以本研究选 择 shRNA 基因作为该新型病毒疫苗的一个重要基因。 1.4 干扰素与口蹄疫免疫 图 3：IFNr 在 APC 与 T 细胞和 B 细胞作用机制中的作用(索布林那，2009) Fig：The role of IFN- in the mechanism of APC with T cells and B cells -干扰素 (Iterferon-，IFN-)具有免疫干扰素之称，其受体是特异性的糖蛋白 (Harris et al., 2005)，有广泛的抗病毒和免疫调节功能。特异性免疫反应被激活时， T 细胞产生包括 - 干扰素在内的与免疫应答相关的细胞因子(Sainz et al., 2005)， IFN- 可使巨噬细胞表面 MHC类分子的表达量增加，增强其抗原递呈能力；增 强巨噬细胞表面表达 Fc 受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体； 促进 B 细胞和 CD8+T 细胞的分化；增强 TH1 细胞的活性，增强细胞免疫功能；对 TH2 细胞的增殖有抑制作用，从而抑制 TH2 细胞产生 IL-4，同时抑制 IL-4 对 B 细 胞的作用，特别是抑制 B 细胞生成 IgE，所以能增强细胞免疫抑制体液免疫。 尽管 、 三种干扰素激发的基因有所相似，然而它们调节的很多基因仍 猪 O 型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 5 然存在一定的差异(Der et al., 1998)，其中 干扰素所激发的基因是 干扰素的两 倍，此种干扰素诱导基因的不同也部分解释了 干扰素比 干扰素具有更好抗 PRV 的现象。空斑形成单位及病毒增殖试验的结果均显示猪 干扰素是三种干扰 素中对抗 PRV 最有效的细胞因子（姚清侠，2007） 。但是 干扰素生物活性以调 节 Fc 受体和 MHCI、II 类抗原的表达尤为突出；对细胞生长的抑制能力也比干扰 素 和 干扰素 强 (Jarosinski and Massa, 2002; Giroux et al., 2003)，在抗体产生的 信号通路中起到免疫调节作用对中和抗体的产生有很大的意义，研究表明牛 -干 扰素(BoIFN-) 在重组口蹄疫疫苗中可显著提高体液和细胞免疫反应 (Shi et al., 2006)， 故本研究选用猪 干扰素基因与其它功能基因重组在口蹄疫疫苗中有很大意义。 从图 3 可以看出 IFN- 在抗口蹄疫过程中的作用机理：当活 FMDV 或灭活 FMDV 疫苗侵染机体时一部分在体液免疫阶段被消灭掉，另一部分在 APC 的作用 下促使细胞产生 MHCII、IL-1，被 T 细胞表面的 TCR 识别后促进干扰素 的分泌， 同时干扰素 能促使 T 细胞分泌干扰素 ，此时 T 细胞增殖并分泌细胞因子 IL- 2、 IL-4、 IL-5、 IL-6，这些细胞因子刺激 B 细胞使其分泌大量的特异性抗 FMDV 的抗体，这些特异性抗 FMDV 的抗体与吸附在 APC 表面被传送到此处的活 FMDV 或灭活 FMDV 疫苗结合产生免疫反应。在此过程中，IFN- 不仅是一种有 效的免疫佐剂，同时也是重要的免疫调节分子，它不仅能增加细胞免疫应答，最重 要的是能增加疫苗介导的针对特异性病原体攻击的保护性，另外显著增强抗原递呈 细胞膜表面 MHCI、MHC类抗原表达，因而激发更有效的抗原递呈过程。 1.5 FMD疫苗研究进展 在各种动物疾病的防控中疫苗接种是特异性预防动物疾病的可靠工具和有效手 段，在 FMD 预防中也取得了显著的成效。发生 FMD 时，需用与当地流行的相匹 配病毒型、亚型的疫苗进行免疫预防。 传统的疫苗一般指的是弱毒疫苗和灭活疫苗，在长期的FMD防控过程中，常 规疫苗取得了显著的成效，但同时也存在着一些不容忽视的缺陷和安全隐患： （1）生产成本高阻碍其推广使用；（2）病毒灭活不全或活毒逃逸带来疫情暴发的 危险，欧洲几次FMD的爆发就是由于病毒灭活不完全或是由于活病毒从生产场地 逃逸而造成的（孙元，2006）；（3）易出现病毒毒力返强或减毒株突变现象。这 些局限性限制了传统疫苗在畜牧业中的应用。为了克服这种种弊端，各种FMD新 型疫苗特别是基因工程疫苗被逐渐开发出来，如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫 苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等（钱平等，2003）， 这些疫苗具有许多传统疫苗无以比拟的优点，更为安全、有效且价廉，将逐步替代 常规疫苗在畜牧业中的使用。 华中农业大学 2011 届本科毕业论文 6 1.6本实验研究的目的与意义 伪狂犬病和口蹄疫是严重危害全球养猪业的两大重要传染病，分别由伪狂犬病 病毒和口蹄疫病毒引起。PRV主要引起猪繁殖障碍性疾病，随着我国养猪业规模化 发展，猪伪狂犬病有流行蔓延趋势，给养猪业带来巨大损失。口蹄疫则是人畜共患 的急性、烈性传染病，由于其传染性极强，而传统的灭活疫苗在生产使用过程中有 灭活不彻底导致病毒逃逸工厂而发生口蹄疫的风险，因此口蹄疫基因工程疫苗的研 究受到高度重视。 本实验将猪 IFN- 基因、靶点位于 FMDV 3B 区段的 shRNA 和两个串联起来 的 FMDV 抗原基因 P1-UbP1 共同插入到转移载体 PIECMV 中，然后和伪狂犬缺失 株 PRV TK-/gE-/LacZ+共转染，通过空斑筛选的方法得到能够双表达 O 型口蹄疫抗 原基因 P1 基因和跟泛素基因融合的 Ubi-P1 基因，同时又能表达猪 IFN- 基因以及 产生针对 O 型口蹄疫 3B 区段的 RNAi 效应，来共同达到最终的抗病毒效果。 2实验材料 2.1菌种、毒株、载体与质粒 伪狂犬弱毒疫苗株 PRVTK-/gE-/LacZ+由农业微生物学国家重点实验室构建保存。 该突变株是将 PRVEa 株 TK 基因缺失 205bp，并在 gE 编码区插入 LacZ 表达盒， 导致 gE 失活的基因缺失标志性疫苗株。 本研究所用工程菌 DH5a、 XL-gold 由本实验室保存。 载体 PIECMV 由本实验马锐硕士研究生构建。 pUC57pansUbiP12A 由上海英骏公司合成。 pCAsIFNgsiF 由本实验室郝根喜硕士研究生构建。 pCApansUbiP12AsiF 由本实验室郝根喜硕士研究生构建。 猪肾传代细胞 PK-15 与非洲绿猴肾细胞 Vero 购自中国典型物保藏中心。 2.2主要药品与试剂 新生牛血清(NCS)购自杭州四季青材料有限公司，使用前经 56灭活 30min。 培养细胞用的 DMEM 粉剂为 GIBCO 公司产品。 氨苄青霉素(Amp) 、胎牛血清均为 Invitrogen 公司产品。 各种限制性内切酶、连接酶、Taq 酶、DNA Marker 均为大连宝生物公司产品。 DNA 回收试剂盒为 TaKaRa 公司产品。 质粒小量和大量制备试剂盒为 OMEGA 公司产品。 脂质体转染试剂盒 LIPOFECTIN2000 和无血清培养基 OPTI-MEM 均为 猪 O 型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 7 Invitrogen 公司产品。 2.3主要培养基及配制 LB 液体培养基：胰蛋白胨 10.0g，酵母浸出物 5.0g，NaCl10.0g，溶于 ddH20 中，完全溶解后用 5mol/LNaOH 调 pH 值至 7.0-7.2，定容至 1000.0mL，在 15 磅高 压下蒸气灭菌 20min，室温保存。 LB 固体培养基：在刚配好尚未灭菌的 LB 液体培养基中加入琼脂粉至终浓度 为 1.5%，高压蒸气灭菌 20min。待培养基温度降至 50左右，加入相应的抗生素， 铺制平板。待培养基凝固后，倒置于 4保存备用。 DMEM 基础培养液(用于常规细胞培养)：取 DMEM 粉末(Gibic, USA)13.5g 溶 于 950 mLddH2O 中，加入 3.7g NaHCO3，用 1mol/L HCl 调 pH 值至 6.8-7.0，定容 至 1000.0 mL，0.22m 滤膜过滤除菌，分装后室温保存备用。 DMEM 细胞生长液：在 DMEM 基础培养液中加入 10%的已灭活新生牛血清、 100g/mL 青霉素、100g/ mL 链霉素，4保存备用。 DMEM 细胞维持液：在 DMEM 培养液中加入 1%-3%的新生牛血清、100g /mL 青霉素、100g/mL 链霉素，4保存备用。 细胞消化液：将 NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na 2HPO4 1.15g、KH 2PO4 0.2g、胰酶 2.5g，依次溶于 900.0mLddH2O 中，待完全溶解后，定容至 1000.0mL，0.22m 滤 膜过滤除菌，分装后置-20保存备用。 2.4缓冲液及其配制 TAE(50)：242.0g Tris 碱，57.1mL 冰乙酸，100.0mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)， 加 ddH2O 定容至 1000.0 mL。 PBS Buffer：将 NaCl 8g、KCl 0.2g、Na 2HPO4 1.42g、KH 2PO4 0.27g 溶于 800.0mLddH2O 中，待完全溶解后，滴加浓 HCl 调节 PH 至 7.4，定容至 1000.0mL，高温高压灭菌后室温保存。 10%SDS：称量 10g 高纯度的 SDS 溶于 80mLddH2O 中，68加热溶解后，滴 加浓 HCl 调节 PH 至 7.2，定容至 100.0mL，室温保存。 0.5 M EDTA：称取 186.1g Na2EDTA. 2H2O 溶于 800.0mLddH2O 中，充分搅拌， 滴加 NaOH 调节 PH 至 8.0，定容至 1000.0mL，高温高压灭菌后室温保存。 2.5其他溶液 TEN：100.0mol/LNaCl ，10.0mol/LTris-Cl ，1.0mol/LEDTA(PH 8.0) LCM： 30.mol/LTris(PH7.5)，5.0mol/LMgCl 2，3.6mol/LCaCl 2，0.5mol/LEDTA 6.0 mmol/L-MoracPtoethnael ，0.5%NP-40，125.0mol/LKCI 华中农业大学 2011 届本科毕业论文 8 空斑筛选 PCR 样品细胞裂解液：0.5%SDS，100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/L Tris-CL，1.0mmol/LEDTA，0.25mg/mL 蛋白酶 K。 2.5空斑筛选与纯化相关试剂 2DMEM（无酚红）：称取 13.4g 无酚红的 DMEM 粉剂，溶于约 400.0 mL 三蒸水中，再加入 3.7g NaHCO3，用浓盐酸调 PH 值至 6.8-7.0，定容至 500.0 mL，0.22m 滤膜过滤除菌，分装后 4保存备用。 低熔点琼脂糖（2%）：称取 2.0g 低熔点琼脂糖粉剂，溶于 100.0 mL 三蒸水中， 高温高压灭菌 30min 后室温保存（用前于 70水浴锅中融化或微波炉小心融化） 。 蛋白酶 K（20mg/mL）：取 100mg 蛋白酶粉剂，溶解于 5.0 mL 三蒸水中，分 装小份，保存于-20。 10%SDS(M/V)：称取 10gSDS 粉末，溶解于 100.0 mL 去离子水中，室温保存。 0.5mol/LEDTA：称取 18.61g EDTA-Na. 2H2O 粉末，溶于约 80.0 mL 水中， NaOH 调 PH 至 8.0 后定容至 100mL，室温保存。 空斑筛选 PCR 样品细胞裂解液：05%SDS，100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/L Tris-CL，1.0 mmol/LEDTA，0.25mg/mL 蛋白酶 K。 2.6寡核苷酸引物 本实验 PCR 所使用的寡聚核苷酸引物如表 1。 表 1：本研究中所用的寡核苷酸引物 Table 1:The oligo primer used in the research 编号 序列 用途 R primer F primer 5- AGCTTTGCGTGACTTTGTGTTTTTC- 3 5- GCAGGGGGCTGTTTCATATACTGAT- 3 鉴定阳性重组子 3实验方法 3.1转移载体 PIECMVUbiP1P1SiFIFN 的构建策略 重组转移载体 PIECMVUbiP1P1SiFIFN 的构建流程如图 4 所示 猪 O 型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 9 PIECMV载体 pCApansUbiP12AsiF pCAsIFNgsiF pIECMVUbiP1P1SIFIFNpUC57pansUbiP12A sIFNgsiFUbiP12 A P12A 图 4：转移载体 PIECMVUbiP1P1SiFIFN 构建流程 Fig.4：Building process of PIECMVUbiP1P1SiFIFN 3.1.1限制性内切酶酶切反应 酶切产物仅用于检测时，取 1L 质粒 DNA 并加入相应的限制性内切酶反应缓 冲液，混合后加入限制性内切酶，指弹混合，瞬时离心后置于 37水浴 3h。若酶 切产物用于回收，根据实际情况可增加质粒的量扩大酶切反应体系。 3.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测 配制 0.8%琼脂糖凝胶（胶的浓度要根据目的条带的大小适当调整，如果是大 片段则需浓度低的琼脂糖凝胶）：20mLddH 2O 中融入 400L（50）TAE ，再加 入 0.16g 琼脂糖，加热至完全溶解，稍微冷却后加入适量 EB。凝胶倒入胶槽，如 有气泡用梳子赶走，插好梳子，等待凝胶冷却凝固。拔出梳子，凝胶放入装有 1TAE 电泳缓冲液的电泳槽，确保缓冲液要淹没凝胶。然后取酶切产物 1.5-3L 与微量 6loading buffer 混合，加于点样孔中，同时取约 2L 的 DNA Marker 点样 作对照。以 100-120V 电压进行电泳。待溴酚蓝电泳到凝胶 2/3 处时，则可结束电 泳。取出凝胶于凝胶成像系统拍照，保存照片。 3.1.3酶切产物的回收 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确后，于长波紫外灯下切取目的条带用琼 脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收获得目的DNA片段（具体回收方法参考该试剂 盒说明书） 。回收过程如下： （1）将切下的目的DNA条带放入1.5mL离心管；（2）加入600LPN液，50 水浴10min，翻转离心管使充分溶解；（3）将上步所得溶液加入吸附柱，室温静置 2min后12000r/min离心60sec ，弃废液；（4）加入600LPW液，静置5min后 12000r/min离心60sec，弃去废液；（5）再次加入600LPW液，12000r/min 离心 60sec，弃去废液；（6） 12000r/min离心2min，开盖静置5min；（7）弃掉收集管， 将吸附柱放入离心管，悬空滴加30-50LEB洗脱液（或ddH 2O） ，37温箱静置 5min。 （8）12000r/min离心2min收集DNA溶液，离心管标记保存。 华中农业大学 2011 届本科毕业论文 10 3.1.4回收产物的去磷酸化反应 在做分子克隆时，为防止单酶切制备的载体在连接反应时发生自连，我们需将 载体进行去磷酸化处理。具体步骤：回收时溶 34L ddH2O 在 50L 体系中加入 2L CIAP，4LBuffer 置于 37反应 30min 后加入 1LCIAP 置于 50反应 15min，用试剂盒进行液体回收溶 20L ddH2O，跑胶检测。 3.1.5目的基因与载体的酶连反应 将回收所得的DNA片段与载体用T4 DNA连接酶进行连接，酶连体系根据大连 宝生物工程有限公司提供的T4 DNA连接酶的说明书进行配备，如表2所示。 表 2：目的基因与载体酶连体系 Table 4：reaction system of Enzyme with target gene and vector 反应体系 体积（L） 载体 目的基因 T4 DNA Ligase(25UL) 10T4 DNA Ligase Buffer ddH2O Total 1 4 1 2 12 20 置于16或4过夜。 3.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化 3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） 从大肠杆菌DH5平板中挑取一个单菌落，接种于 2mLLB液体培养基中，37 200r/min摇床振荡培养过夜，按1：100转接到装有 50mLLB的盐水瓶中，继续培养 约3-4h ，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中， 冰上放置30min，于44000r/min离心10min。弃上清，将离心管倒置 1min使残留培 养液流尽。加10ml 冰预冷的0.1mol/LCaCl 2重悬沉淀，冰浴30min后，44000r/min 离心10min。弃上清，沉淀中加入2mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬。悬浮的感受 态细胞可马上用于转化。如保存，则需加入无菌甘油到终浓度为15%，分装0.1mL/ 管，-80 冰箱保存备用。 3.2.2质粒的转化 将载体与cDNA或DNA基因片段的连接产物与 100L感受态细胞混匀，冰浴 30min；42水浴热冲击90sec；冰浴2min；若是转化质粒，则取 3050L菌液直接 涂布含相应抗生素的LB平板；若转化连接物，则加入 0.4mL 37预热的LB 培养基， 37振摇培养45min；5000r/min离心3min，弃去450L的上清后，将剩余的部分直 猪 O 型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 11 接涂布含相应抗生素的LB平板，37培养1216h 后，出现转化菌落。 3.2.3质粒的小量制备(OMEGA 试剂盒) （1）将带有质粒的 E.coil 接种于 5mLLB/抗生素培养液中，37搖床培养 1216 h；（2）取 1.05.0mL 的菌液，室温下 10,000g 离心 1min 收集细菌。 （3）倒 弃培养基。加入 250uLSolution I/RNaseA 混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。 （4） 往重悬混和液中加入 250uLSolution II，轻轻颠倒混匀 4-6 次。此操作避免剧烈混 匀裂解液且裂解反应不要超过 5 min。 （5）加入 350uLSolution，温和颠倒数次至 形成白色絮狀沉淀。 （6）室温下，10,000g 离心 10min。 （7）转移上清液至套有 2mL 收集管的 HiBind DNA 结合柱中，室温下 10,000g 离心 1 min，倒去收集管中 的滤液。 （8）把柱子重新装回收集管，加入 500uLHB Buffer，按上述条件离心，弃 去滤液。 （9）把柱子重新装回收集管，加入 700uLDNA Wash Buffer，按上述条件 离心，弃去滤液。 （10）弃去滤液，重复第 9 步骤一次。(11)弃去滤液，把柱子重 新装回收集管， 10,000g 离心空柱 2min 以甩干柱子基质。(12)把柱子装在干净的 1.5mL 离心管上，加入 30-50uLElution Buffer(10mmol/L Tris-HCl, PH8.5)或无菌水 到柱子基质中，静置 1-2min，10,000g 离心 1min 洗脱出 DNA。 3.2.4质粒的大量制备（OMEGA 试剂盒） (1)将带有质粒的 E.coil 接种于 100-200mLLB抗生素培养液中，37摇床培 养 12-16h。(2)取 100-200 mLLB 菌液，室温下 3,000-5,000g 离心 10min 收集菌液。 (3)倒弃培养基，加入 10mLSolutionIRNaseA 混合液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。 (4)往重悬混合液中加入 10mLSolution，轻轻颠倒混匀 10-15 次后可将混合液室温 放置 2min 以提高产量。(5) 加入 5mL 冰浴 BufferN3，并温和颠倒离心管数次至形 成白色絮状沉淀。准备好过滤器。(6)把 HinBind 大量柱套在收集管中，加入 5mLBuffer GPS 至柱中，静置 3-10min。室温 3,000-5,000g 离心 5min。去滤液，把 柱子重新放回收集管中。(7) 把裂解液倒入事先准备好的针筒过滤器中，静置 2min。(8)插入并轻推活塞使裂解液流进下面的收集管中。(9)在过滤澄清的裂解液 中加入 110 体积的 ETR，颠倒 7-10 次后溶液变得浑浊，冰浴 10min。(10)42水 浴 5min 后，253,000-5,000g 离心 5min，ETR 溶液将在管底形成蓝色分层。离心 后，如果溶液有大量的液滴悬浮，静置 10min 让液滴自然沉降。(11)转移上清液至 离心管中，加入 0.5 倍体积的无水乙醇，混匀后室温静置 1-2min。(12)取一干净的 HinBind 大量柱装在 50mL 收集管中。转移 20mL 混合液至柱子内，室温下 3,000- 5,000g 离心 3-5min，倒去滤液。(13)重复第（12）步，把剩余的过滤液转移至柱子， 直至所有的溶液都从柱子滤出。(14)把柱子重新放回收集管，加入 10mLHB Buffer，按上述条件离心，弃滤液。(15)把柱子重新放回收集管，加入 15mLDNA 华中农业大学 2011 届本科毕业论文 12 Wash Buffer，按上述条件离心，弃滤液。 (16) 弃去滤液，重复步骤（15）一次。 （17）弃去滤液，把柱子重新放回收集管，最大速度（6,000g）离心 10-15min 以 甩干柱子基质。 （18）把柱子放在干净的 50mL 离心管中，加入 1-3mLElution Buffer，弃上清，室温下静置 2min 后最大速度（6,000g）离心 5min 以洗脱 DNA。 3.2.5阳性质粒的酶切鉴定 挑取转化的菌落，接种于 4mL 含相应抗性的 LB 液体培养基中。37培养过 夜，小量制备质粒 DNA，用合适的限制性核酸内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，紫外灯观察，鉴定重组质粒。另外，可以通过测序的方法进一步鉴定阳性质 粒。 3.3以 PRV为载体表达 FMDV抗原蛋白基因 P1，泛素蛋白与抗原 P1 的融合基因 Ubi- P1，RNA 干扰基因 shRNA，干扰素基因 IFN- 的 重组病毒的构建 3.3.1细胞的培养、冻存与复苏 （1）细胞的培养：无菌台上将已长成单层的细胞培养瓶倾去培养液，用 PBS 液洗 1-2 遍后，加入 1mL 胰酶 37消化数分钟，弃去胰酶，加入新鲜生长液吹打 分散，按 1:3 或 1:4 传代。 （2）细胞的冻存：无菌台上将刚长成单层的细胞用胰酶消化好后，弃尽胰酶， 用少量细胞冻存液（100mL 瓶冻存 1-2 管）吹打分散细胞，按约 1.5mL 每管分装于 细胞冻存管中。先于 4放置 40min-1h，-80过夜后转入液氮罐中可保存数年 （或-80 可保存 1-3 个月） 。 （冻存液配法有二：一为 9 份的血清+1 份的 DMSO； 另一种为 70%DMEM+20%血清+10%DMSO ） （3）细胞的复苏：将水浴锅预先调至 37，生长液加入细胞瓶并 37预热， 然后从液氮罐中（或-80冰箱）取出一管冻存的细胞，置水浴锅中快速融化，于 无菌台中将细胞液转入细胞瓶中，375%CO 2 培养箱静置培养， 6h 换新生长液 （已预热）继续培养。 ） 3.3.2 PRV TK-/gE-/LacZ+基因组 DNA的提取 将 PRV 弱毒株 TK-/gE-/LacZ+接种于已长成单层的 PK-15 细胞，37培养至 80%的 细胞出现病变，用吸管吹打使细胞从瓶壁上脱落，在 48000r/min 离心 15min 收 集细胞。将细胞沉淀重悬于细胞裂解液 LCM 使细胞裂解，冰浴 5-10min 后，加入 猪 O 型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 13 三氯三氟乙烷抽提，摇匀 5min，43000r/min 离心 10min，吸取上清于另一干净离 心管，再加入三氯三氟乙烷抽提一次，摇匀 5min，43000r/min 离心 10min，取上 清，48000r/min 离心 10min，取上清，加到 5%-45%的甘油梯度上（加入的上清 体积不超过甘油体积的 10%） ，在电子天平上平衡，260