hplc法测定患者血浆中氯吡格雷羧酸代谢产物的血药浓度

HPLC 法测定患者血浆中氯吡格雷羧酸代谢产物的血药浓度 刘丽娜 1* , 夏泉 2,3, 黄燕 2，许杜娟 1#,2，3 （1.安徽医科大学药学院， 2.安徽医科大学第一附属医院药剂科 , 3.国家中医药管理局中药化学三级 实验室，安徽 合肥 230032） 摘 要：目的 建立一种简易快速的 HPLC-UV 法测定人血浆中氯吡格雷羧酸代谢产物 （CCA）的浓度。 方法 以苯妥英钠为内标，血浆样品经 6%高氯酸液-液萃取。使用 Hypersil ODS2 (4.6250mm,5m)，流动相为（0.05M 磷酸二氢钾，三乙胺调 PH 至 5.7）： 乙腈（78:22） 。紫外检测羧酸氯吡格雷（CCA）的波长为 220nm，流速 1.0ml/min,柱温 50。结果 羧酸氯吡格雷（ CCA）血药浓度范围在 0.10-8.0g/ml 范围内线性关系良好 (r=0.9995);平均回收率为 100.75%；分析方法最低检测线 0.05g/ml。日内、日间 RSD 均 3%,冻融稳定性 RSD 均10%（n=5） 。结论 本方法简便，准确，灵敏度高，专属性和稳定性 较好，适用于氯吡格雷制剂的临床研究和药动学研究。 关键词 ： 氯吡格雷；氯吡格雷羧酸代谢产物；高效液相色谱法；血药浓度 High-performance liquid chromatographic determination of inactive carboxylic acid metabolite of clopidogrel in human plasma LIU Lina1* ，XIA Quan 2,3，HUANG Yan 2, XU Dujuan 1#,2,3 ， （1. School of Pharmacy, Anhui Medical University, 2. Department of Pharmacy ,the First Affiliated Hosp- ital of Anhui Medicine University, 3. Third-Grade Pharmaceutical Chemistry Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Anhui Hefei 230032, China） ABSTRACT ： Objective To establish a simple and rapid method（HPLC-UV）for the determination of carboxylic acid metabolite of clopidogrel (CCA) in human plasma. Method The analytical procedure involves liquidliquid extraction of the analyte and an internal standard （phenytoin sodium）with chemical reagent-6% perchloric acid. The separation was achieved using Hypersil ODS C18 (4.6250mm,5m) analytical column with mobile phase consisting of 0.05M phosphate buffer containing triethylamine（pH 5.7）and acetonitrile（78 :22 v/v）at detector wavelength of 220 nm. The flow rate was 1.0ml/min and the column temperature was set at 50. Result A good linearity was shown in the concentration range of 0.10 8.0g/mL（r=0.995）; the average recovery was 100.75%;the LOQ was found to be 0.05 g/ml. Both the inter-day and intra-day RSD were lower than 3%;the freeze-thaw stability RSD was less the 10%（n=5 ） . Conclusion The method was convenient, reliable, sensitive which could be applied in the clinical investigation and pharmacokinetic study of clopidogrel . KEY WORDS：clopidogrel; carboxylic acid metabolite of clopidogrel; HPLC; concentration 氯吡格雷(clopidogrel)是一种新型的噻吩并吡啶类衍生物，具有抗血小板聚集作用及 抗血栓形成作用。 其作用机制是通过选择性地与血小板表面ADP受体结合来抑制血小板的 聚集，目前它已被广泛应用于冠脉支架植入术中术后预防急、慢性血栓形成 1。氯吡格雷 为前体药在体内代谢氧化成含氧化合物，而后水解成一种硫醇衍生物为其活性代谢产物。 此前药及其活性代谢产物极不稳定在血浆中几乎检测不到，而氯吡格雷无活性的羧酸代谢 物在血液循环中具有较高浓度，常用于做氯吡格雷的生物等效性及药动学研究。本研究首 次建立了用HPLC-UV联用测定人血浆中氯吡格雷羧酸代谢物的血药浓度的方法，该方法具有 快速，简便，准确的优点为临床应用及个体化治疗方案提供参考。 1 材料 1.1 仪器 Ailgent 1100 高效液相色谱系统配 DAD-G1315B 检测器(美国 Ailgent 公司)，AB135-5 电子天平（上海梅特勒多-托利多） ，Hypersil ODS C18色谱柱（ 4.6250mm 5m） （大连 依利特分析仪器有限公司） ；XW-80A 旋转震荡器（上海医科大学仪器厂） ；TGL-185 高速冷 冻离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司） 。 1.2 试药 氯吡格雷羧酸代谢产物(CCA)对照品（含量：98%） （加拿大 TRC）及苯妥英钠对照品 (中检所)。甲醇，乙睛为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。健康人血浆由安徽 医科大学第一附属医院检验科提供，氯吡格雷羧酸代谢产物血浆样品取自安徽医科大学第 一附属医院门诊及住院服用氯吡格雷的病人。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱 Hypersil ODS C18（4.6250mm 5m） ；流动相：（0.05M 磷酸二氢钾，三乙 胺调 PH 至 5.7） ： 乙腈为（78:22） ；流速 1.0ml/min,；柱温 50；紫外检测波长为 220nm；进样量：20L；Ailgent 1100 色谱工作站。 2.2 储备液的配制 分别精密称取氯吡格雷羧酸代谢产物对照品和苯妥英钠对照品适量，用甲醇溶解并稀 释，配制成浓度为 100g/ml 的储备液，置于 4冰箱中保存备用。 2.3 血浆样品预处理 精密吸取 200L 的患者血浆，置于 1.5ml 具塞圆底塑料离心管中，加内标苯妥英钠储 备液 10L,涡旋混匀 2min,加 6%的高氯酸 50L 涡旋混匀 2min。14000r/min 离心 10min,取 上清液再次 14000r/min 离心 10min,取上清液置于进样瓶中，进样 20L。 2.4 色谱行为 在上述色谱条件下，羧酸氯吡格雷和苯妥英钠的保留时间分别为 7.6min，19.8min。 羧酸氯吡格雷和苯妥英钠与血浆中其他组分色谱峰分离良好,理论塔板数 n=3000，分离度 R1.5，结果见图 1 t/min t/min t/min A B C 图 1 血浆中羧酸氯吡格雷的 HPLC 色谱图 (A.空白血浆； B.空白血浆+ 羧酸氯吡格雷+ 苯妥英钠；C.患者血浆;1.羧酸氯吡格雷；2.苯 妥英钠) Fig 1 HPLC chromatograms of carboxylic acid metabolite of clopidogrel in human plasma （A. Blank human plasma; B. Blank human plasma+ CCA +phenytoin sodium ; C. sample; 2 1 2 2 1 1 1.CCA;2. phenytoin sodium） 2.5 标准曲线及线性范围 用空白血浆将羧酸氯吡格雷储备液稀释成浓度为 0.10，0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8g/ml 的系列的溶液。按“2.3”项下方法处理并测定，以所测测定血药浓度（X）为横坐标，所 测药物与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程及线性范围。结 果如下：y=0.1499x+0.0551 (R=0.9995) ,最低检测线 0.05g/ml，说明在 0.10g/ml 至 8.0g/ml 浓度范围内线性关系良好。 2.6 精密度 分别配制 0.5 , 2.0, 4.0g/ml 的羧酸氯吡格雷低，中，高 3 种质量浓度的对照品血 浆，每一浓度平行操作 5 份，于同一日按“血浆样品预处理”项的方法操作后进样分析， 计算日内精密度。连续 5 天按此法操作，综合 5 天的数据计算日间精密度。羧酸氯吡格雷 日内，日间精密度 RSD 均小于 10%，方法精密度良好。结果见表 1。 2.7 回收率 2.7.1 方法回收率 分别配制 0.5 , 2.0, 4.0g/ml 的羧酸氯吡格雷低，中，高 3 种质量浓度的对照品血 浆， “血浆样品预处理”的操作，每一浓度平行操作 5 份，按“血浆样品预处理”项的方法 操作后进样分析，代入回归方程计算浓度，以计算值和加入值的比值计算方法回收率，羧 酸氯吡格雷的方法回收率大于 99.7%小于 102.5%,确保了定量的准确性和可靠性。结果见表 1。 2.7.2 提取回收率 分别配制 0.5 , 2.0, 4.0g/ml 的羧酸氯吡格雷低，中，高 3 种质量浓度的对照品血 浆，按“血浆样品预处理”的操作，每一浓度平行操作 5 份后进样分析。另配制与血浆中 相同浓度的羧酸氯吡格雷对照品溶液，与样品中含量相等的羧酸氯吡格雷比较，记录峰面 积计算提取回收率。高，中，低三个浓度的提取回收率均大于 75.3%。结果见表 1 表 1 回收率和精密度实验结果（n=5） Tab 1 Results of precision and recovery tests 日内 日间 加入量 g/ml 测量值 g/ml RSD % 测量值 g/ml RSD % 方法回收率 % 提取回收率 % 0.5 0.498 0.004 0.72 0.4950.005 1.0 75.7 99.7 2.0 1.9950.014 0.70 1.9430.042 2.1 76.2 99.8 4.0 3.997 0.013 0.35 3.9710.041 1.18 75.3 100.2 结果表明，日内，日间精密度 RSD 均小于 3%。平均方法回收率大于 99.7%，小于 102.5%，平均提取率均大于 75.3%。适用于血药浓度检测和药动力学研究。 2.8 血浆样品冻融稳定性 用空白血浆配制羧酸氯吡格雷 0.5 , 2.0, 4.0g/ml 低，中，高 3 个质量浓度的样品， 在-40冰箱中冷冻后取出，在 0,24,48,72h 后按“样品预处理的方法”测定羧酸氯吡格雷 的浓度。结果羧酸氯吡格雷低，中，高 3 个质量浓度的测得值 RSD 分别为 1.0%，2.1%，1.18%，稳定性 RSD 均小于 10%，表明样品在-40条件下稳定。 2.9 患者血药浓度检测 从门诊及住院病房共收集到 10 例急性冠状动脉综合症(ACS)的患者血样,其中有 2 例 （样本序号 1，2）患者是经皮介入治疗(PCI)前晚给予氯吡格雷负荷剂量 300mg 给药后 4 小时采集血样于肝素抗凝管中，分离出血浆，于40冰箱保存待测。其余 8 例病人为 PCI 术后规律服用氯吡格雷 75mg/d 超过 7 天，病人在当天早上服药后 3 小时采集血样测其 羧酸氯吡格雷血药浓度。结果见表 2。 表 2 患者羧酸氯吡格雷血浆浓度测定结果 Tab 2 Concentration of carboxylic acid metabolite of clopidogrel in patients 样本序 号 性别 年龄（岁） 服药剂量（mg/d） 实测浓度（g/ml） 1 男 65 300 1.122 2 男 58 300 0.958 3 男 64 75 2.927 4 女 57 75 2.721 5 女 54 75 1.982 6 男 69 75 2.002 7 女 61 75 1.678 8 女 59 75 1.923 9 男 56 75 2.302 10 女 63 75 1.781 3 讨论 3.1 氯吡格雷作为抗血小板药物是冠心病患者经皮冠状动脉介入术后预防血栓事件的标准 治疗药物之一。然而由于个体对氯吡格雷反应性存在差异，有 5%-30%患者在常规剂量服用 氯吡格雷后存在抵抗现象而发生临床不良心血管事件 2。氯吡格雷的抵抗影响了冠心病患 者的临床预后，增加了不良心血管事件的发生率 3。氯吡格雷抵抗的研究成为现在研究的 热点。目前一些研究发现羧酸氯吡格雷血药浓度和服用氯吡格雷的临床预后具有一定的相 关性，并用羧酸氯吡格雷来作为氯吡格雷药代动力学的指标 4。因此测定羧酸氯吡格雷的 血药浓度可以对研究氯吡格雷抵抗机制以及指导氯吡格雷进行个体化给药提供帮助。 3.2 氯吡格雷羧酸代谢产物的测定方法目前有 HPLC 及 LC-MS/MS 法等。该研究使用 HPLC- UV 法测定氯吡格雷羧酸代谢产物色谱条件稳定，色谱峰分离度高，峰型对称。流动相中用 三乙胺调 pH 增加仪器灵敏度。实验过程中曾比较二氯甲烷，正乙烷，乙醚，6%高氯酸萃取 羧酸氯吡格雷，发现 6%高氯酸萃取率最高。该研究与文献报道 5方法相比具有以下特点： （1）样品预处理较为简单；（2）流速较低可使出峰时间和血浆中杂质峰充分分开。以苯 妥英钠为内标使用 HPLC-UV 法测定血浆中的羧酸氯吡格雷浓度具有专属性好，灵敏度高， 线性范围广，稳定性好等特点，该法可适用于氯吡格雷药物动力学及药物临床研究，也可 用于使用氯吡格雷病人羧酸氯吡格雷的血药浓度的常规检测。 3.3 本研究共分析了 10 例患者的血药浓度，由于氯吡格雷药物体内药代动力学过程主要包 括吸收、分布、代谢和排泄,而吸收和代谢过程受 ABCB1 及 CYP450 酶单核苷酸多态性 （SNP）的影响，另药物的相互作用，年龄，体重，患者生活习惯及肝肾功能也会影响其血 液浓度 6，即使患者服用同一剂量血药浓度仍有差异。 参 考 文 献 1 Jolanta M, Siller-Matula,Katrin Haberl,et al. The effect of antiplatelet drugs clopidogrel and aspirin is less immediately after stent implantation J.Thrombosis Research,2009,123(6):874. 2 Turgay Celik, Atila Iyisoy, Husamettin Gul,et al. Clopidogrel resistance: A diagnostic challengeJ.International Journal of Cardiology,2009,131（ 2）:267. 3 Zhi Jian Wang, Yu Jie Zhou, Yu Yang Liu, et al. Impact of clopidogrel resistance on thrombotic events after percutaneous