pcr技术基本原理及相关知识

PCR 技术基本原理 PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡 核苷酸引物。PCR 由变性- 退火- 延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离， 使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火(复性) ：模 板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结 合；引物的延伸：DNA 模板 -引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复 制链重复循环变性-退火- 延伸三过程，就可获得更多的“ 半保留复制链” ，而且这种新链又可成 为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几 百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR 的反应动力学 PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y(1X)n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数， X 表示平(Y)均每次的 扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到 理论值。反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增 的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称 平台期数、PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大 多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR 反应体系的基本成分：模板 DNA、特异性引物、DNA 聚合酶、dNTP、 Mg2+的缓冲液。 PCR 反应体系与反应条件 - 标准的 PCR 反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10100pmol 模板 DNA 0.12ug Taq DNA 聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补 的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物， 利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。 引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。 引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二 聚体，产生非特异的扩增条带。 引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配 对而导致 PCR 失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分 析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓 度 0.11umol 或 10100pmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起 错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶， 另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2。5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状， 如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会 使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50200umol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相 等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低) ，就会引起错配。浓度 过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜 上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白 质 结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与 氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色 体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各 种 dNTP 浓度为 200umol/L 时， Mg2+浓度为 1.52.0mmol/L 为宜。Mg2+ 浓度过高，反应特异 性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR 反应条件的选择 PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火- 延伸三个温度点。在标准反 应中采用三温度点法，双链 DNA 在 9095变性，再迅速冷却至 40 60，引物退火并结 合到靶序列上，然后快速升温至 7075，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延 伸。对于较短靶基因(长度为 100300bp 时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸 温度可合二为一，一般采用 94变性，65左右退火与延伸(此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催 化活性)。 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下， 9394lmin 足以使模板 DNA 变性，若低于 93则需延长时间，但温度不能过高，因为高 温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失 败。 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷 却至 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之 间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度 、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸，G+C 含量约 50%的引物， 55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温 度： Tm 值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm 值-(510) 在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。 延伸温度与时间：Taq DNA 聚合酶的生物学活性： 7080 150 核苷酸/S/酶分子 70 60 核苷酸/S/酶分子 55 24 核苷酸/S/酶分子 高于 90时， DNA 合成几乎不能进行 。 PCR 反应的延伸温度一般选择在 7075之间，常用温度为 72，过高的延伸温度不利 于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb 以内的 DNA 片段，延伸时间 1min 是足够 的。34kb 的靶序列需 34min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长 些。 循环次数 循环次数决定 PCR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓度。 一般的循环次数选在 3040 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR 产物的电泳检测时间 一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR 循环 条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有 Taq 酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别 是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物 质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效 而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。 需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不 理想、容易弥 散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不 对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液 做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条 引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低， 在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致 引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性，浓度 过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多 大体积进 行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要 模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火 温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩 增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物 与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。 假阳性 出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假 阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染， 这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致 假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩 增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的 酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要 时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当 提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸 )。 出现片状拖带或涂抹带 PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓 度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的 酶。减少 dNTP 的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理:提取 组织或细胞中的总 RNA,以其中的 mRNA 作为模板,采用 Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA.再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,而获得目的基因或检测基因表达 .RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性 提高了几个数量级,使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能.该技术主要用于:分析基因的转录产物,获取目 的基因,合成 cDNA 探针,构建 RNA 高效转录系统. Trizol 法 RNA 提取步骤 标记 EP 管，分 3 组 第一组 EP 管加入氯仿 0.2ml，二组加入异丙醇 0.5ml，三组加入 75%乙醇 1ml 1ml Trizol、心或肺 50100mg、液氮依次加入到研钵中，研碎 收集组织液 1.5ml 至 EP 管，离心：15000rmp 、4 、15min 取上清，转移至氯仿组，摇晃 15s，冰上放置 10min 离心：15000rmp、4、15min 取上清，转移到异丙醇组的 EP 中，冰上放置 20min 离心：15000rmp、4、15min 弃上清，加 75%乙醇 1ml（0.1%DEPC 水配制） 离心：15000rmp、4、5min 弃上清，干燥 15min，加 100ul DEPC 处理的水 RT-PCR 引物的选择 随机引物 适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA 的反 转录反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反应。 Oligo dT 适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA。 （原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具有 PolyA 尾巴。 ）由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上，所以对 RNA 样品的质量要求较高， 即使有少量降解也 会使全长 cDNA 合成量大大减少。 基因特异性引物 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的 SuperScript One-Step System 特别适合于与基因特异性 引物连用。 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异 性扩增带与非特异性扩增带。 原因 建议 引物特异性差 重新设计引物，改变引物的位置和长度，增强其特异性或使用巢式 PCR引物 引物浓度过高 适当减少引物浓度 Mg2+浓度 Mg2+浓度过高 适当降低 Mg2+浓度，从 1mM 到 3mM，间隔 0.5mM 进行一系列反应，确定对于每个模板和 引物对的最佳镁离子浓度。 耐热聚合酶 酶量过多 以 0.5U 为间隔适当减少酶量 退火温度 退火温度过低 适当提高退火温度或采用二阶段温度法 PCR 循环次数 PCR 循环次数过多 减少 PCR 循环次数 4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减 少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管 电泳法 定义：是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂 糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳 动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方 法。 电泳技术的基本原理和分类 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘 积。FQE 质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从 Stoke 定律，即 ：F6r 式中 r 为质点半径， 为介质粘度， 为质点移动速度，当质点在电场中作 稳定运动时：FF 即 QE6 r 可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘 度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。 电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。前者包括 Tise-leas 式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳 （常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺 凝胶）等。 自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂 贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。本节仅对常用的几种区带 电泳分别加以叙述。 影响电泳迁移率的因素 电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物 ，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为 20cm，测得的电位降为 200V，那么 电场强度为 200V/20cm10V/cm。当电压在 500V 以下，电场强度在 2-10v/cm 时为常压电泳。 电压在 500V 以上，电场强度在 20-200V/cm 时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加 速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。 溶液的 pH 值 溶液的 pH 决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷 量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团（-COOH ），又有碱性基团（ -NH2）的两性电解质， 在某一溶液中所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，蛋白质在电场中不再移动， 溶液的这一 pH 值为该蛋白质的等电点（isoelctric point，pI）。若溶液 pH 处于等电点酸侧，即 pHpl，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液 pH 处于等电点碱侧，即 pHpl， 则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的 pH 离 pl 越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越 大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的 pH 值缓冲液。 溶液的离子强度 电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电 质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成一个与运动质点符合相反的离子氛（ionic atmosphe re），离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离 子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的 pH 值，影响质点的带电量 ，改变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度 I 表示。 电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。其产 生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子 ，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附 OH-带负电荷，与纸接触 的水溶液因产生 H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速 度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择 低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。 电泳分析常用方法 （二）凝胶电泳 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电 泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE ）普遍用于分离蛋白 质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同 工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广，介绍如下： 琼脂糖凝胶电泳的原理概述 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是 D-半 乳糖和 3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖 束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。 在临床生化检验中常用于 LDH、CK 等同工酶的检测。 琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术 在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA 分子的电 泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环 DNA直线 DNA开环双链 DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状 DNA（球形）不能进入胶中 ，相对迁移率为 0，而同等大小的直线 DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大 于 0。 设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖 凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的 有 TBE（0.08mol/L TrisHCl，pH8.5，0.08mol/L 硼酸，0.0024mol/L EDTA）和 THE（0.04m ol/L TrisHCl。pH7.8，0.2mol/L 醋酸钠，0.0018mol/L EDTA）。 凝胶制备：用上述缓冲液配制 0.5-0.8琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融 化，冷至 55时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为 0.5g/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃 板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板 0.5-1.0mm，待脱凝固 后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下 1mm 处。 样品制备与加样：溶解于 TBE 或 THE 内的样品应含指示染料（0.025溴酚蓝或桔黄橙 ）、蔗糖（10-15）或甘油（5-10），也可使用 2.5Fico 增加比重，使样品集中， 每齿孔可加样 5-10g。 电泳：一般电压为 5-15V/cm。对大分子的分离可用电压 5V/cm。电泳过程最好在低温条 件下进行。 样品回收：电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需要的 DNA 分子或特殊片 段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收，如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的 凝胶，将其装入透析袋（内含适量新鲜电泳缓冲液），扎紧透析袋后，平放在水平型电泳槽两 电极之间的浅层缓冲液中，100V 电泳 2-3 小时，然后正负电极交换，反向电泳 2 分钟，使透析 袋上的 DNA 释放出来。吸出含 DNA 的溶液，进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回 收。 废弃溴化乙锭 EB 净化和处理方法 1 严禁随便丢弃。因为 EB 是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。 2 废 EB 溶液的处理方法 (1) 对于 EB 含量大于 0.5mg/ml 的溶液，可如下处理： a. 将 EB 溶液用水稀释至浓度低于 0.5mg/ml； b. 加入一倍体积的 0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入等量的 25mol/L HCl，混匀，置室温数小 时； c. 加入一倍体积的 2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 (2) EB 含量小于 0.5mg/ml 的溶液可如下处理： a. 按 1mg/ml 的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置 1 小时； b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。 3 废 EB 接触物，如抹布，枪头。 一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。 PCR 扩增产物的电泳分析 凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. 一、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海 藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂 糖.低熔点琼脂糖熔点为 6265，溶解后在 37下维持液体状态约数小时，主要用于 DNA 片 段的回收，质粒与外源性 DNA 的快速连 接等. (一)凝胶浓度 凝胶浓度的选择依 DNA 分子的大小而定. 琼脂糖凝胶的浓度与 DNA 分离范围 琼脂糖浓度(%) 线型 DNA 分子的分离范围(Kb) 0.3 560 0.6 120 0.7 0.810 0.9 0.57 1.2 0.96 1.5 0.23 12.0 0.12 (二)电泳缓冲液 核酸电泳缓冲液有三种，即 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和 Tris-磷酸(TPE).TBE 与 TPE 缓冲容量高，DNA 分离效果好，但 TPE 在 DNA 片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使 DNA 沉 淀.TAE 缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用 TBE.缓冲液中的 EDTA 可螯合 二价阳离子， 从而抑制 DNA 酶的活性，防止 PCR 扩增产物降解. 10XTBE 缓冲液的配制 Tris 硷，108 克 EDTA，9.3 克 硼酸，55 克 H2O 至，1000ul (其 PH 应为 8.08.2) 临用时用水稀至 0.5XTBE(20 倍稀释. (三)核酸电泳的指示剂与染色剂 1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫 兰色，在 0.6%、1%、1.4%和 2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与 1Kb、 0.6Kb、0.2K b 和 0.15Kb 的双链线性 DNA 片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和 1.4%琼脂糖中 电泳时，其迁移速率分别与 2Kb 和 1.6Kb 的双链线性 DNA 大致相似. 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400 组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有增加样 品 密度，使其比重增加，以确保 DNA 均匀沉入加样孔内.在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可 预测核酸电泳的速度和位置.使样品呈色，使加样操作更方便. 染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其 次是 银染色. 溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB 分子可嵌入核酸双链的碱基对 之 间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml 的 EB ，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色 1015min.琼脂 糖凝胶 EB 染色，肉眼 可见核酸电泳带，其 DNA 量一般5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时 ，可将凝胶放入蒸馏水浸泡 30min 后再观察. 银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使 A g+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂 糖凝胶染色.其灵敏度比 EB 高 200 倍.但银染色后，DNA 不宜回收. (四)电泳 1.电泳装置: 电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等. 2.电泳方法: (1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子. (2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般 200400bp 的 DNA 片段， 可 配制 1.21.7%浓度的琼脂糖用于电泳.