rt-pcr中遇到的问题及解决方法

RT-PCR 中可能遇到的问题及处理方法 摘要：本文就在 RT-PCR 实验中可能遇到的，包括在琼脂糖凝胶电泳分析中看到少量或 没有 RT-PCR 产物、在琼脂糖凝胶分析中看到非预期条带、多聚糖同 RNA 共沉淀、cDNA 第 一链合成错误或数量少、RNA 二级结构太多等问题进行分析，并提出了相应的可能的处理 方法。 RT-PCR 为反转录 RCR（reverse transcription PCR）和实时 PCR（real time PCR）共同 的缩写。逆转录 PCR，或者称反转录 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合 酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。由一条 RNA 单链转录为互补 DNA(cDNA)称作“逆 转录”，由依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA 的另一条链通过脱氧 核苷酸引物和依赖 DNA 的 DNA 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的 PCR。原先的 RNA 模板被 RNA 酶 H 降解，留下互补 DNA。 RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的 RNA。RT-PCR 广泛应 用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种 RNA 的含量。RT-PCR 的关键步骤在是 RNA 的反转录，要求 RNA 模版为完整的且不含 DNA、蛋白质等杂质。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 RT-PCR 技术相关试试剂: oligo: 多聚体，相当于 mRNA 引物 AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶 MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 dNTPs：脱氧核苷酸 RNase：RNA 酶抑制剂 PCR Buffer：RT-PCR 缓冲液 MgCl2：2 价镁离子 1.2 方法 1.2.1 RNA 提取 组织剪碎加入 1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停） 。转入一新 EP 管中 （1.5ml） ，室温保存 5min。加氯仿 0.2ml，振荡混合（手摇剧烈） ，室温放置 5min。10000 rpm 4离心 15min。转移上层水相（吸 70%）到一新 EP 管中，加异丙醇 0.5ml,振荡混合，室温保存 10min。12000rpm 4 离心 15min。倒掉上清，加 1ml 75%无水乙醇（4保存） ，振荡混合，10000rpm 4 离 5min。倒掉上清，室温或 37 放置 20min(EP 管倒置在滤纸上)使 RNA 沉淀干燥。加 20ul DEPC 水至 EP 管中。在 60 孵育 3-5min(或手握 3-5min),使 RNA 充分溶解。 1.2.2 测 RNA 浓度 调零：750ul DEPC 水 测量：745ul DEPC 水 + 5ul RNA 总 RNA 浓度= OD 26040稀释倍数（150 倍）ug/ml = OD26040150 ug/ml = OD2606 ug/ul A1/A2应在 1.8-2.0 之间 1.2.3 逆转录（以 Fernentas 试剂盒为例，反应体系 20ul） RNA 短暂离心。将 11ul 的 DEPC 水和 RNA（1ug）放入 EP 管内，置于冰上，使 RNA 终浓度为 0.5ug/ul,再加入 Oligo(dt) 1ul,轻轻混合均匀，短时间离心。将反应液置于 65 5min 冰上 1min,短时间离心。按顺序加入：5buffer4ul。200ul 核糖核苷酸酶 抑制剂 1ul。10mm dNTP MIX2ul。M-Mulu 逆转录酶 1ul，轻轻混合均匀，短时间离心。 将混合物置于 42，60min。70加热 5min,中止上述反应，置于冰上。 1.2.4 RT-PCR（以 25 ul 反应体系为例） RTPCR 反应体系(25ul)： 无酶水 14.4ul AMV Buff 目的基因 5ul dNTP 0.5ul 目的基因上游引物 0.75ul 目的基因下游引物 0.75ul GAPDH 上游引物 0.75ul GAPDH 下游引物 0.75ul MgSO4 0.8ul Tfl DNA Poly 0.5ul RNA 0.8ul 将上述各成分混匀并覆盖石蜡油 20 l，标注号码后放入基因扩增仪内。RT-PCR 扩增的条件与参数：48，45min，94，2min； 94 30s，58 60s，68 2min 共 40 个循环；循环完毕后 68延伸 7min。扩增产物进行电泳或-20C 冻存。 2 讨论 2.1 可能遇到的问题及处理方法 2.1.1 琼脂凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物可能的原因及处理方法 1.RNA 被降解：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA；使用良好的无污染 技术分离 RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理；在 100甲酰胺中储存 RNA 如果使 用胎盘 RNase 抑制剂，不要加热超过 45或 pH 超过 8.0，否则抑制剂或释放所有结合 的 RNase。而且，在0.8mM DTT 时加入 RNase 抑制剂，一定要存在 DTT； 2.RNA 中包含逆转录抑制剂：过乙醇沉淀 RNA 除去抑制剂。用 70（v/v）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25g 到 0.4g/l）以帮助小量样品 RNA 的恢 复；逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐；将对 照 RNA 同样品混合，同对照 RNA 反应比较产量以检验抑制剂； 3.多糖同 RNA 共沉淀：使用氯化锂沉淀 RNA 以除去多糖； 4.用于合成 cDNA 第一链合成的引物没有很好退火：确定退火温度适合您的引物。 对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在 25保温 10 分钟；对于基因特异性引 物（GSP），可以试一下其他 GSP，或换用 oligo(dT)或随机六聚体确定 GSP 是反义序列； 5.起始 RNA 量不够：增加 RNA 量；对于50ng 的 RNA 样品，可以在第一链 cDNA 合 成中使用 0.1g 到 0.5g 乙酰 BSA； 6.RNA 模板二级结构太多：将 RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火；提 高逆转录反应温度，对 SuperScript可以到 50，对 ThermoScript 可以到 65。注 意：不要在60时使用 oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的 GSP；对于 1kb 的 RT-PCR 产物，保持反应温度65。注意：不要在高于 37时使用 M-MLV； 如果不需要全长 cDNA，在第一链反应中使用随机引物； 7.引物或模板对残余的 RNA 模板敏感：在 PCR 前用 RNaseH 处理。 8.靶序列在分析的组织中不表达：尝试其他靶序列或组织。 9.PCR 引物设计较差：避免在引物 3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构 的序列。设计 Tm 类似的引物。最佳引物浓度介于 0.1M 到 0.5M 之间。为了精确确 定引物浓度，在 260nm 测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。 10.富含 GC 的模板：于 GC 含量50的模板，使用 PCRx Enhancer Solution。 11.镁离子浓度太低：从 1mM 到 3mM，间隔 0.5mM 进行一系列反应，确定对于每个 模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量 PCR，使用 3mM 到 5mM 的镁离子浓 度。 12.退火温度太高：利用公式估算 Tm，把退火温度设定为低于 Tm 5。因为公式只 是估算 Tm 值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。 2.1.2 在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带的原因及处理方法 1.引物和模板非特异性退火：在第一链合成中使用 GSP，而不是随机引物或 oligo(dT)。试用允许高温 cDNA 合成的 GSP。 2.GSP 设计较差：遵循用于扩增引物设计的同样原则。 3. RNA 中沾染了基因组 DNA：使用扩增级 DNase处理 RNA。使用没有逆转录的对 照反应检测 DNA 污染。 4.形成引物二聚体：设计在 3端没有互补序列的引物。 5.引物和模板非特异性退火：以 2到 5间隔增加退火温度，减少退火时间；在 开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度；使用 Platinum Taq DNA 进行自动热启动 PCR；避免在引物 3端含有 2 到 3 个 dG 或 dC； 6.镁离子浓度太高 ：对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。 7.因为扩增复杂模板导致引物错误起始：使用巢式 PCR 或递减 PCR。 8.沾染外源 DNA：使用抗气雾剂的吸头和 UDG。 9.因为二级结构导致引物结合位点无法接近：对于 GC 含量50的模板，使用 （1-3）PCRx Enhancer Solution。 2.1.3 PCR 反应灵敏度低的原因及处理方法 1. 初始模板 RNA 不充分：增加模板 RNA 的浓度；使用 10ng-1?g 的总 RNA。 2. RNA 被损害和降解：必要的话更换 RNA。 3. RNAse 污染：维持无菌条件；加入 RNase 抑制剂。 4. 无效的 cDNA：通过增加 70乙醇清洗的次数来去除制备 RNA 过程中的抑制剂。 5. 无效的 PCR 扩增：注意：反转录的抑制剂包括 SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷 酸钠和亚精胺。调整 cDNA 合成温度或引物设计。 2.1.4 PCR 忠实性低（PCR 在产物序列中引入了错误）的原因及处理方法 1.聚合酶忠实性低：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如 Platinum Pfx DNA 聚 合酶。 2.循环数太多：降低循环数。 3.四种 dNTP 的浓度不同：制备新的 dNTP 混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预 混合物。 参考文献 1