芹菜素对裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 芹菜素对裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制 作用的研究 摘要 目的 探 芹菜素 （APG）对裸鼠肝癌皮下移植瘤的抑制 作用及其相关机制。 方法 建立人肝癌 阿霉素（ADM）耐药细胞 BEL- 7402/ADM 裸鼠皮下移植瘤模型，24 只 移植成功的裸鼠随机分为三组：对照组 （ADM 3 mg/kg） 、APG 组（APG 50 mg/kg+ADM 3 mg/kg）和 miR-101 mimics 组（miR-101 mimics 5 mg/kg+ADM 3 mg/kg） ，每组 8 只。上 述药物每 3 天注射 l 次，共 7 次。给药 结束后处死裸鼠，切取移植瘤组织。免 疫组化法检测 Ki-67 蛋白表达评价肿瘤 细胞增殖，免疫蛋白印迹法检测肿瘤组 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 织核转录因子红细胞系相关因子- 2（Nrf2）蛋白的表达， qRT-PCR 法测 定移植瘤组织 miR-101 水平。 结果 与 对照组相比，APG 和 miR-101 mimics 能显著抑制肿瘤生长（P 中国论文网 /6/view-12955730.htm 关键词 芹菜素；肝癌；化疗增 敏；核转录因子红细胞系相关因子- 2；miR-101 中图分类号 R965 文献标识码 A 文章编号 1673-7210（2017） 09（b）-0009-04 Inhibiting effect of apigenin on hepatocellar carcinoma xenografts in nude mice GAO Aimei1 CHENG Xiaoli2 1.Department of Pharmacy， the Fifth Peoples Hospital of Shanghai， Fudan University， Shanghai 200240， China； 2.Department of Pharmacy， Shenzhen Baoan District Maternity and Child Health Care Hospital， Guangdong -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 Province， Shenzhen 518133， China Abstract Objective To investigate the effect of apigenin （APG ） on hepatocellar carcinoma xenografts in nude mice and the possible molecular mechanism. Methods Models of nude mice were transplanted with BEL- 7402/doxorubicin （ADM） ， and randomly divided into 3 groups， each group had 8 mice. The groups of mice were treated i.p. as follow： ADM （3 mg/kg， control group） ， APG+ADM （50 mg/kg+3 mg/kg， APG group） ， miR-101 mimics +ADM （5 mg/kg+3 mg/kg， miR-101 mimics group） ， every three days for a total of seven times. The volumes of tumor were measured. After the end of medication， the mice were sacrificed for measurement of tumor weights. Tumor cell proliferation was analyzed by Ki-67 immunostaining. Nuclear factor erythroid-2-related factor 2 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 （Nrf2） protein level was measured by Western blot. miR-101 level was detected by Real-time PCR. Results The volumes and weights of tumors in APG group and miR-101 mimics group were decreased compared with the control group （P 0.05）. Compared to the control group， APG and miR-101 mimics resulted in inhibition of tumor cell proliferation （P 0.05 or P 0.01） ， inhibition of Nrf2 expression （P 0.01） ， and up- regulation of miR-101 levels （P 0.05）. Conclusion APG can inhibit the growth of hepatocellar carcinoma， its mechanism may partly be to inhibit the expression of Ki-67 and Nrf2， up- regulate the level of miR-101. Key words Apigenin； Hepatocellular carcinoma； Chemosensitization； Nrf2； miR-101 芹菜素（4 ，5，7- trihydroxyflavone，apigenin，APG）是 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 天然存在的一种黄酮类化合物，广泛存 在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中。 研究发现，芹菜素具有抗氧化、抗诱变、 抗炎症、抗肿瘤等多种药理活性1-4。 多项研究表明芹菜素对肿瘤具有抑制作 用，其主要作用机制包括抗肿瘤细胞增 殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞 侵袭、转移以及抗氧化等5-8。因此， 芹菜素作为一种天然高效低毒的抗肿瘤 药已成为目前肿瘤治疗研究的热点之一 9-10。笔者前期实验发现，APG 可逆 转人肝癌阿霉素（doxorubicin，ADM） 耐药细胞 BEL-7402/ADM 的耐药，增 强 ADM 化疗敏感性，增加胞内 ADM 的蓄积11。APG 这种协同抑癌 作用可能与下调耐药细胞核转录因子红 细胞系相关因子-2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）信号 通路有关。为了进一步研究 APG 在体 内的抗肿瘤活性，本研究构建裸鼠肝癌 皮下移植肿瘤动物模型，探讨 APG 的 体内抗肿瘤活性及相关机制，以期为肝 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 癌耐药的治疗提供有益的参考。 1 材料与方法 1.1 试剂与材料 APG，陕西慧科植物开发有限公 司；RPMI-1640，美国 GIBCO 公司； 小牛血清，杭州四季青生物工程公司； 胰蛋白酶，美国 Amresco 公司； ADM，浙江海正药业股份有限公司； 鼠抗人 Ki-67 单克隆抗体、即用型二步 法（非生物素）免疫组化检测试剂盒， 北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗 人 Nrf2 抗体，美国 Santa Cruz Biotechnology 公司；辣根过氧化物酶 标记羊抗兔 IgG，美国 Jackson 免疫研 究实验室；TRIzol ，美国 Invitrogen 公 司；实时荧光定量 PCR 试剂盒， TaKaRa 公司；定量 PCR 仪，美国 ABI 公司。 1.2 细胞和动物 BEL-7402/ADM 人肝癌耐药细胞 购自南京凯基生物科技公司，常规培养 于含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 液中，置于 5%CO2、37细胞培养箱 内传代培养。BALB/c-nu 雌性裸小鼠， 体重为 2224 g，鼠龄 45 周，购于 北京华阜康生物公司，动物合格证号： SCXK（京） 2014-0004。按规定饲养于 实验动物中心的 SPF 屏障系统内。 1.3 裸鼠肝癌模型的建立及分组 给药 取对数生长期的 BEL-7402/ADM 细胞，经胰酶消化，离心洗涤 2 次后， 用生理盐水调整至浓度为 3107/mL。 取细胞悬液 0.3 mL，用 1 mL 注射器将 细胞接种到裸鼠右腋下皮下组织，10 d 左右可触及米粒大小结节。挑选出体积 为 50 mm3 左右的裸鼠 24 只进行分组： 对照组（ADM 3 mg/kg 腹腔注射） 、 APG 组（APG 50 mg/kg+ADM 3 mg/kg 腹腔注射）和 miR-101 mimics 组 （miR-101 mimics 5 mg/kg 瘤内注射 +ADM 3 mg/kg）腹腔注射，每组 8 只。 上述药物每 3 天腹腔注射 l 次，共 7 次。 给药后每 3 天测移植瘤体积。移植瘤体 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 积按公式 V=ab2/2（a=瘤长，b=瘤宽） 计算12-14，并绘制生长曲线。末次给 药后第 2 天，颈部脱臼法处死荷瘤鼠， 剥离瘤体，观察大体形态并称取瘤重。 1.4 免疫组化检测 瘤组织经 4%多聚甲醛固定后包 埋脱水，制成 5 mm 厚的切片。切片常 规脱蜡，加入 3%过氧化氢室温孵育 10 min，PBS 漂洗 3 次；用 0.01 mol/L 柠 檬酸盐缓冲液微波修复 5 min，PBS 漂 洗 3 次；加入正常兔血清 37孵育 15 min，以封闭非特异性抗原；加一抗 Ki- 67 多克隆抗体（1200） ，37孵育 2 h，PBS 漂洗 3 次；滴加相应的二抗， 37孵育 20 min，PBS 漂洗 3 次；DAB 显色，苏木精复染核，逐级脱水，透明， 封片。染色结果的判定标准：细胞核可 见棕黄色颗粒，即 Ki-67 染色阳性表达。 每张切片随机选取 5 个高倍视野，计数 阳性染色细胞数，计算平均增殖指数。 增殖指数=（阳性染色细胞数/肿瘤细胞 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 总数）100% 。 1.5 Western blot 检测 取适量瘤组织，搅碎成匀浆，裂 解获得蛋白。根据 BCA 试剂盒说明对 蛋白浓度进行测定。蛋白上样，SDS 凝 胶电泳，转膜，一抗孵育，4过夜， 二抗室温孵育 1 h，于凝胶成像系统中 曝光。用 Image J 软件对各抗体条带灰 度值进行统计。 1.6 qRT-PCR 检测 TRIzol 提取组织总 RNA，按试 剂盒说明将总 RNA 反转录成 cDNA， 以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，以 U6 为内参。miR-101 上游引物：5- CGGCGGTACAGTA CTGTGATAA- 3，下游引物 5- CTGGTGTCGTGGAGTC？鄄 GGCAATTC-3；U6 上游引物 5- CTCGCTTCGGCAGCA？鄄 CA-3，下 游引物 5-AACGCTTCACGAATTTG？ 鄄 CGT-3。反应条件：95 15 min，95 15 s，55 20 s，70 30 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 s，30 个循环反应。实验结果应用 2- Ct 方法进行相对定量分析。 1.7 统计学方法 采用 SPSS 13.0 统计学软件进行 数据分析，计量资料数据用均数标准 差（xs）表示，多组间比较采用单因 素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验，以 P 0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 裸鼠一般情况和肿瘤生长状 况 接种 10 d 左右，裸鼠皮下可见粟 粒大小的类圆形结节，质硬，不可活动。 在接种后的前 20 d，肿瘤增长缓慢，裸 鼠精神良好，反应敏捷，饮食、大小便 及活动正常，移植瘤未见破溃；在接种 后的第 2130 天，肿瘤增长速度开始 加快，裸鼠精神状态较之前变得萎靡不 振、活动减少、反应迟钝、消瘦等；从 第 30 天以后，肿瘤增长速度更加迅速， 裸鼠变得愈加萎靡不振，基本上不活动， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 饮食和饮水量急剧减少，身体愈加消瘦。 整个实验过程中无裸鼠意外死亡。 5 Lu HF，Chie YJ，Yang MS，et al. 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