有机氯农药与肿瘤相关基因dna间的作用机制研究

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 有机氯农药与肿瘤相关基因 DNA 间 的作用机制研究 摘要：利用紫外可见（UVvis） 吸收光谱、荧光（FL）光谱和圆二色谱 （CD）研究了 3 种有机氯农药 DDT， DDE 和 DDD 与人类肿瘤 相关基因（p53 DNA 和 Cmyc DNA）的 相互作用，阐明有机氯农药的基因毒性。 UVvis 和 FL 光谱实验表明， 有机氯农 药主要通过嵌插方式与 DNA 碱基作用， 形成非共价复合物。通过 FL 实验得到 的农药分子与 p53 DNA 的结合能力顺 序为：DDEDDTDDD，对 Cmyc DNA 为：DDDDDEDDT；并通过计 算结合过程的热力学常数证实以疏水作 用为主要的作用力。CD 实验表明， 部 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 分有机氯农药能够影响 DNA 的碱基对 堆积和二级结构，很可能进一步造成 DNA 损伤，并最终导致基因突变。 中国论文网 /8/view-12767064.htm 关键词：有机氯农药； 脱氧核 糖核酸； 相互作用； 光谱法； 嵌插 作用 1 引言 有机氯农药主要以苯或环戊二烯 两大类为原料，曾作为杀虫剂被广泛使 用于农业生产中，其化学性质稳定和难 以分解的特性造成了环境的严重污染。 接触有机氯农药后，罹患白血病、乳腺 癌、中枢神经系统（CNS）肿瘤以及 Wilms 肿瘤的风险增大1，2。已有研 究表明， 有机氯农药能对人体血红细 胞和淋巴细胞中 DNA 造成损伤，具有 诱导基因癌变的可能性3，4。80%肿 瘤疾病受到环境因素的影响5，6。因 此有必要在分子水平上探讨环境中有机 小分子与人类肿瘤相关 DNA 间的作用 机制。小分子物质与 DNA 之间的非共 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 价结合方式主要有嵌插结合、沟区结合 和静电结合，其中当小分子嵌插到 DNA 碱基对之间后，可以直接抑制 DNA 的复制与转录，甚至使 DNA 链断 裂受损。此外，有机小分子可能会与 DNA 形成加合物而引起 DNA 的损伤， 有可能产生诱变作用而最终引发癌变 7，8。 p53 基因是一种抑癌基因，人 类癌症中约有一半是由于该基因发生突 变失活，是迄今发现与人类肿瘤相关性 最高的基因912 。Cmyc 基因是一种 可使细胞获永生化功能，促进细胞分裂 的基因13 ，14。研究发现， 多种肿瘤 疾病中都发现有 Cmyc 基因的扩增或过 度表达15 ，16。 本研究选择 3 种有机氯农药 DDT 及其在环境中脱氧化氢产物 DDE 和还原产物 DDD（图 1）为研究对象， 利用一些谱学方法系统研究这些农药与 人体肿瘤相关基因（p53 抑癌基因和 Cmyc 癌基因）启动子区双螺旋 DNA 间的相互作用，希望能为农药生物毒性 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 的解析、肿瘤疾病的预防和治疗提供线 索。 3 结果与讨论 3.1 紫外滴定实验研究有机氯农 药分子与 DNA 的作用模式 研究证明，有机小分子与 DNA 的相互作用会引起小分子的特征吸收带 出现红移（蓝移）现象或增色（减色） 效应。尤其是以嵌插方式与 DNA 碱基 对发生作用时，小分子的光谱变化会更 明显。随着 DNA 的加入，有机氯农药 分子溶液的 UVvis 吸收光谱变化明显。 由图 2A 可知，在加入 p53 DNA 之后， 有机氯农药 DDE 在 213 和 288 nm 处的 特征吸收峰分别发生了 15 和 11 nm 的 红移，同时减色程度分别为 63.8%和 30.2%，并且在 337 nm 处出现等吸收点。 而在加入 Cmyc DNA 之后， DDD 的光 谱信号变化最为显著，其位于 209 和 243 nm 处的特征吸收峰分别减色 55.8% 和 42.9%，209 nm 处特征紫外吸收峰出 现了 8 nm 的红移，在 298 nm 处出现了 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 等吸收点，而 243 nm 处特征吸收峰的 位移不明显。吸光度的显著减弱以及吸 收带发生红移都证实了有机氯农药分子 嵌插入 DNA 的碱基对之间与 DNA 结 合17，等吸收点的出现说明有机氯农 药分子和 DNA 之间形成非共价复合物 18。 3.3 荧光竞争实验比较有机氯农 药分子与 DNA 作用的亲合能力 溴化乙锭（EB）是一种具有共轭 芳香环的平面分子，在 TrisHCl 缓冲溶 液中，单独的 EB 荧光非常弱，但它能 平行地嵌入双螺旋 DNA 的碱基对中， 使荧光显著增强。本实验利用 EB 作为 目标 DNA 的荧光探针，通过荧光竞争 实验研究有机氯农药分子与 DNA 嵌插 作用的亲合力。结果表明，随着有机氯 农药浓度不断增加，DNAEB 体系的荧 光强度逐渐减弱，表明有机氯农药分子 会和 EB 竞争与 DNA 结合于 DNA 的作 用位点（图 3） ，使得嵌插在 DNA 碱基 对中的 EB 不断被置换出来。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 小分子与 DNA 的相互作用有可 能受多种作用的共同影响，通过在荧光 光谱实验中改变溶液的离子强度来判断 有机氯农药分子与 DNA 分子之间是否 有静电作用。溶液中离子强度的增加能 够抑制有机氯农药分子与 DNA 分子之 间通过静电作用相互结合，表现为荧光 猝灭减弱。本实验利用强电解质 NaCl 控制有机氯农药和 DNA 体系的离子强 度，实验见表 3。由表 3 可知，在加入 NaCl 溶液后，有机氯农药与 DNA 溶液 体系的荧光强度未增大反而减小，表明 有机氯农药和 DNA 之间没有静电作用。 双链 DNA 之间由于磷酸基团带有负电 荷而产生静电斥力，随着离子强度增大， Na+中和了 DNA 磷酸根的负电荷，减 弱了 PO3+4 之间的斥力，使 DNA 双螺 旋结构分子轴向收缩，表现为荧光强度 的减小22。 静态猝灭中，猝灭剂的存在不改 变荧光分子激发态的寿命，动态猝灭中， 猝灭剂的存在可导致其荧光寿命缩短。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 由表 6 可知，有机氯农药分子 DDD 和 DDT 在加入 DNA 前后荧光寿命变化较 小，表明有 DDD 与 DDT 与 DNA 之间 的猝灭模式为静态猝灭，而随着 DNA 的加入 DDE 的荧光寿命明显增大，表 明 DDE 与 DNA 的沟区之间也有一定 的相互作用25 。 3.7 圆二色谱研究有机氯农药分 子对 DNA 结构的影响 小分子不仅能够通过嵌插等作用 影响 DNA 碱基对的堆积，而且能够影 响 DNA 的双螺旋结构。CD 谱中， 260280 nm 处的正峰对应 DNA 碱基 对堆积，245 nm 处的负峰对应 DNA 双 螺旋结构的 B 型构象26 。当有小分 子与 DNA 分子发生相互作用，影响 DNA 分子结构，其 CD 谱会发生变化。 图 6 为结合最为显著的 2 种有机氯农药 与相应 DNA 溶液的 CD 谱图。对于 p53 DNA，农药 DDE 的加入使得 DNA 正负峰都明显减弱，这说明 DDE 的加 入不但会削弱碱基对之间 堆积作用， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 而且影响了 DNA 的双螺旋结构构象， 会导致双螺旋结构的松散甚至发生解链； 而 DDD 和 DDT 对 p53 DNA 的 CD 谱 没有明显影响。对于 Cmyc DNA，农药 DDD 的加入使得 DNA 正负峰都发生减 弱，这说明 DDD 的加入能够削弱了 Cmyc 碱基对之间 堆积作用，并对其 构象造成一定影响；DDT 和 DDE 的加 入使得 Cmyc DNA 负峰明显减弱，说 明对 DNA 的双螺旋结构有较大影响。 造成这种差异的原因是由于有机氯农药 的毒性与其分子形状和大小有关， Mullin 的假设即强调了分子构型对分子 毒性的影响27 。DDT 中的三氯甲基和 DDE 中双键的空间位阻较大，抑制苯 环平面结构的自由旋转，不利于其分子 以最优的角度嵌插入 DNA 碱基对间28， 影响了 DNA 双螺旋 B 型构象。而 DDD 苯环平面结构能够自由旋转，有利于 DDD 嵌插入 DNA 碱基对，所以 DDD 能够同时影响 DNA 的碱基对堆积和 B 型构象。 4 结论 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 综上所述，不同农药分子对 DNA 作用力大小存在显著差异，其中 DDD 和 p53 DNA 结合能力最强，而与 Cmyc DNA 结合能力最弱，具有较为显 著的结合特异性。有机氯农药 DDD、DDT 、DDE 都基本以嵌插方式 与 DNA 发生作用，瞬态荧光实验证明 DDE 与 DNA 双螺旋的沟区也存在一定 的相互作用。热力学函数的计算结果表 明有机氯农药分子和 DNA 之间的作用 力类型主要存在疏水作用。CD 实验以 及紫外升温证明有机氯农药能够影响 DNA 碱基对间的堆积作用或 DNA 双螺 旋结构，造成 DNA 稳定性降低。这些 影响可能是有机氯农药分子具有致癌作 用的原因。 References 1Ma X M， Buffler P A， Gunier R B， Dahl G， Smith M T， Reynolds P. Environ. Health Perspect， 2002， 110： 955-960 2Cordier S， Mandereau L， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 PrestonMartin S， PrestonMartin S， Little J， Lubin F， Mueller B， Holly E， Filippini， G， PerisBonet R， McCredie M， Choi N W， Arslan A. Cancer Causes Control， 2001， 12： 865-874 3Borja J， Taleon D M， Auresenia J， Gallardo S. Process Biochem.， 2005， 40： 1999-2013 4Tiemann U. Reprod Toxicol， 2008， 25： 316-326 5Minetti C A， Remeta D P， Zharkov D O， Plum G E， Johnson F， Grollman A P， Breslauer K J. Mol. Biol.， 2003， 328： 1047-1060 6Hendry L B， Mahesh V B， Bransome E D， Ewing D E. Mutat. Res.， 2007， 623： 53-71 7Arif J M， Dresler C， Clapper M L， Gairola C G， Srinivasan C， Lubet R A， Gupta R C. Chem. Res. Toxicol， 2006， 19： 295-299 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 8Phillips D H. Carcinogenesis， 2002， 23： 1979-2004 9Meek D W. Nat. Rev. Cancer， 2009， 9（10）： 714 -723 10Scott H E，Chen X B. Cell Biochem.， 2007， 100（4）： 883- 896 11Ford J M. Mutat. Res.， 2005， 577（12）： 195-202 12Petitjean A， Mathe E ， Kato S， Ishioka C， Tavtigian S V， Hainaut P， Olivier M. Hum. Mutant.， 2007， 28（6）： 622-629 13Fravera R D， WongStaal F， Gallo R C. Nature， 1982， 299： 61- 67 14Gail Y， Heidi H， Margaret K， Leonard H. Augenlicht. Cancer Res.， 1985， 45： 4433 15Stein C A， Cheng Y C. Science， 1993， 261： 1004-1009 16Jenks S. Natl. Cancer Inst.， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 1993， 85： 266-278 17Steven A T， Robert J M， A David B， Thomas C S. J. Phys. Chem.， 1993， 97： 1707-1710 18Long E C， Barton J K. Acc. Chem. Res.， 1990， 23（9）： 271- 273 19Lakowicz J R. Principles of Fluorescence Spectroscopy 2nd edition. （Kluwer Academic/Plenum Publishers， New York，1999 20Giuliano K A， Post P L， Hahn K M， Taylor D L. Annu. Rev. Biophys. Stru