中老年肝细胞癌患者乙型肝炎病毒x基因检测与分析

【摘要】 目的 检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染后肝细胞癌 (HCC)患者血清 HBV X 基 因，并与慢性乙型肝炎、肝硬化患者 HBV X 基因检出率对比分析。方法 在微孔板上包 被 HBV X 基因片段的捕获探针； PCR 扩增被检标本中目的片段，其引物用 Bio dUTP 修饰，在微孔板上杂交后用链霉亲和素碱性磷酸酶系统显色。结果 该方 法检测 HBV X 基因灵敏，特异；乙型肝炎后 HCC 患者 HBV X 基因检出率明显高于慢性 乙型肝炎组和肝硬化组。结论 检测 HBV X 基因对 HCC 具有辅助诊断价值。 【关键词】 乙型肝炎病毒； X 基因；肝细胞癌 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的主要致病原因之一，是乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus， HBV)的持续感染1 。在我国，HBV 携带者达到全部人口的 10%15%。HBV 感染机体以后，存在高比率的慢性化。长期的慢性感染，尤其到达中老 年时期常常导致 HCC 的发生。研究表明，HBV X 基因及其表达的蛋白(HBx) 能广泛激活病 毒与细胞启动子，参与基因调控，与 HCC 的发生发展密切相关2 。本文应用微孔板杂 交技术检测中老年慢性 HBV 感染者血清中的 HBV X 基因，对其与 HCC 的相关性进行研 究。 1 材料与方法 1 1 研究对象 HBV 感染后 HCC 患者 30 例，其中男 23 例，女 7 例，年龄 4271(平均 52)岁。慢性 乙型肝炎患者 25 例，男 15 例，女 10 例，年龄 3257(平均 41)岁。肝硬化患者 14 例，男 8 例，女 6 例，年龄 3864(平均 48)岁。全部研究病例均来自北华大学附属医院肝病科住 院患者，病例诊断依据为 2000 年西安第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议制定的病毒 性肝炎防治方案 3 。 1 2 实验材料 HBV X 基因扩增引物 5 CTGGATCCTTCGCGGGACGTCCTT 3，5 GTTCACGGTGGTCTCCAT 3 。5端修饰 Bio dUTP HBV X 基因引物。PGEM T Vector Systems 和 JM109 Competent：购于 Promega 公司。NUNC Maxisorp 单条可拆微孔板。 1 3 实验方法 基因重组技术制备微孔板包被探针:应用 HBV X 基因引物扩增 HBV X 基因片段。将 扩增后的 DNA 片段回收纯化，并与 PGEM T Vector 连接，转化到 JM109 大肠杆菌内,选 阳性重组体进行扩增，酶切制备 HBV X 基因片段。紫外定量后，用包被缓冲液配成 5 /ml ，在 NUNC Maxisorp 微孔板上每孔加入 50 l 进行包被，封闭，4 冰箱保存备用。 HBV X 基因检测。主要针对课题中选定的研究对象进行检测血清中的 HBV X 基因。用 5端修饰的 Bio dUTP 的 PCR 引物进行基因扩增。扩增后将 PCR 产物进行变性处 理，在微孔板上进行杂交，最后用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素显色。应用酶标仪，以 405 nm 波长进行比色，测定每孔吸光度 A 值。阳性判断标准为：测定孔 A 值/阴性对照孔 A 值2 1 为阳性。 2 结 果 2 1 微孔板杂交技术检测 HBV X 基因 PCR 扩增所得 HBV X 基因片段如图 1，微孔板杂交后检测结果如图 2。 2 2 各组 HBV X 基因检测结果 HCC 患者 HBV X 基因检出率明显高于慢性乙型肝炎和肝硬化患者(P0 05)，见表 1。表 1 各组 HBV X 基因检测结果(略) 3 讨论 HBV 慢性感染导致 HCC，其原因之一是 HBV X 基因及表达产物 HBx 作用的结果。 HBV X 基因是 HBV 整个基因组中最小的一个开放读码框架 (ORF)，编码基因位于 1 3741 838 核苷酸之间，全长为 465 bp，其编码的 X 蛋白由 154 个氨基酸组成。 Koike4等将 X 基因导入 CD 1 系小鼠的胚胎细胞，诱发 84%的鼠的肝脏发生肿瘤并 伴有 HBx 的高度表达，为 X 基因的致癌作用提供了直接证据。有人认为 HBV X 基因是病 毒的癌基因，在没有基因变异的情况下，X 基因能直接诱导 HCC 的发生5 。本课题结果 证实 HCC 患者 HBV X 基因的检出率明显高于慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者。因此，检 测 HBV X 基因在 HCC 的诊断上具有重要意义。 参考文献： 1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮 158 例疗效观察J;广东医学;1997 年 10 期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮 126 例J;中国中医药科技;1999 年 06 期 3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会J;江西中医药;/xyfm/class/.2002 年 05 期 4 张随学 ,谭正辉 ,孙叶梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韩峰;3003 例痤疮患者特征分析与控制对策J; 中华医学美学美容杂志;/xyfm/class/.2002 年 06 期 5 刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗 J;临床医药实践杂志;2003 年 09 期 6 高宜云;痤疮从肝论治J;中医药临床杂志;2004 年 03 期 7 欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮 J;中华皮肤科杂志;2004 年 09 期 8 陈五一;痤疮辨治体会J;世界中医药;/yisheng/main/index.php.2007 年 03 期 9 雷放;中药热敷治疗痤疮有效 J;新中医;/book/main/index.php.1992 年 09 期 10 李东华;异维生素 A 酸治疗痤疮J;新医学 /;1993 年 10 期 11 黄灿奇;针刺联合中药内服外敷治疗青少年痤疮临床观察D;南方医科大学;2011 年 12 陈志彬;中医综合疗法对女性痤疮患者皮肤生理指标影响研究D; 广州中医药大学;2011 年 13 陈传伟;针刺干预慢性疲劳综合征的临床及作用机理研究D;广州中医药大学;2010 年 14 Hamid Abdi;针刺对伊朗肥胖者的体重及抗热休克蛋白 27、60、65、70 的影响D; 北京 中医药大学;/book/main/index.php.2010 年 15 陈玉骐;背俞穴刺络放血治疗痤疮的临床研究 D;广州中医药大学;2009 年 16 张随学;电针镇痛的脑功能磁共振初步研究 D;复旦大学;2005 年 17 庞莹;痤疮的流行病学及与雄激素受体基因多态性的相关研究D;中国医科大学;2008 年 18 申鹏飞;“醒脑开窍”针刺方法治疗卒中后抑郁症基础与临床疗效及治疗机制研究D; 天 津中医学院;/qikan/class/?150.html.2004 年 19 姜文;针刺干预脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经细胞Ca（2+）i 变化的信号传导机