丹参酮ⅱa磺酸钠对angⅱ诱导心房成纤维细胞胶原合成及tgf—β1活化

描述：目的：观察丹参酮A 磺酸钠（sodium tanshinone A sulfonate， STS）对血管紧张素 （angiotensin ， Ang）诱导 心房成纤维细胞胶原合成及 TGF-1活化. 摘要 目的：观察丹参酮A 磺酸钠（sodium tanshinone A sulfonate， STS）对 血管紧张素（angiotensin ， Ang）诱导心房成纤维细胞胶原合成及 TGF-1活化的 影响。方法：培养新生大鼠心房成纤维细胞，检测胶原含量，并3H- 脯氨酸掺入法测定 胶原合成速率作为心肌纤维化指标。ELISA 法检测培养细 胞上清中活性 TGF-1及总 TGF- 1含量。发表论文网 Western blot 测定血小板反应素-1（thrombospondin-1，TSP-1 ） 表达。结果：Ang能够明显上调心房成纤维细胞胶原含量、胶原合成速 率；TSP-1 表达 及活性 TGF-1分泌量上调，而总 TGF-1表达无明显改变。在 STS 处理后，除总 TGF-1 外，其他指标均明显下调。结 论：STS 能减轻 Ang诱导心房成纤维细胞胶原分泌及合成 速率，机制与抑制 TSP-1/TGF-1通路有关。 心房颤动（房颤）为临床最常见的快速性心律失常，严重危害人类健康，可致心功能 不全及脑栓塞等并发症，明显增加患者死亡率。新近研究提示在多种因素所致房颤模型， 均可见显著的心房纤维化（atrial fibrosis），后者干扰局部激动传导，造成单向传导阻滞， 增加冲动不均一性和碎裂电活动，促进房颤维持。因此，心房纤维化是房颤维持的关键因 素，严重损害心功能2 。寻找治疗心房纤维化的治疗方法是改善房颤患者愈后的新途径。 研究表明血管紧张素（angiotensin ， Ang）是心房纤维化发病机制中重要的 一环，可通过血小板反应素-1（thrombospondin 1，TSP-1）/转化生长因子-1（TGF- 1）途径诱导 心肌重构3-4 。我国传统中药丹参临床上主要用于冠心病的治疗，本室也发 现其能抑制心肌重构， 但其对心房纤维化研究尚少。本实验利用培养的新生大鼠心房成纤 维细胞，研究丹参的主要成分丹参酮A 衍生物“ 丹参酮A 磺酸钠”（sodium tanshinone A sulfonate， STS）对 Ang诱导的胶原分泌及合成速率，TSP-1/TGF-1 通路的影响， 探讨 STS 抗 MF 的可能机制， 为其在临床用于防治心房纤维化提供实验依据。 1 材料 1.1 动物 12 d 龄新生 Wistar 大鼠，由同济医学院 实验动物中心提供，动物许可证 号 SCXK（鄂）2004-0007。 1.2 试剂与 仪器 Ang（ Sigma 公司）；STS（中国食品药品检定研究院，批号 S02001300）；DMEM 干粉培养基、胰蛋白 酶、胎牛血清、3H- 脯氨酸（中国科学院上 海原子能研究所）；PMSF 和 leupeptin（Sigma 公司）； PVDF 膜（Amersham 公司）；羟 脯氨酸试剂盒及 TGF-1 ELISA 试剂盒（南京建成生物工程有限公司）；小鼠抗大鼠 TSP- 1（Santa Cruz 公司）；其余试剂为国产分析纯。LS3810 液体闪烁仪（Beckman 公司）， 垂直电泳仪及转膜系统（Biorad 公司）。 2 方法 2.1 新生大鼠心房成 纤维细胞（atrial fibroblasts， AFs）培养 取 12 d 龄的 Wistar 大鼠，在无菌条件下开胸剪取心室肌，无菌条件下剪碎心肌，0.1%胶原酶消化液消化后， 加入含 10 胎牛血清的 IMDM 培养液制成细胞悬 液，调整 细胞密度为 1105 个/mL，根据 心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁 1 h，去除心肌细胞获得成纤维细 胞。继续培养细胞至近融合状态时按 12 传代。传代后成纤维细胞用抗波形蛋白 （Vimentin）单克隆抗体免疫细胞化学染 色鉴定，纯度达到 95%。实验用第 35 代的细 胞。 2.2 分组 共分为 5 组，分别为对照组，给予生理盐水；Ang （0.1 molL-1） 组； Ang（0.1 molL-1）+STS （3 molL-1）组；Ang （0.1 molL-1） +STS（10 molL-1）组；Ang（0.1 molL-1）+STS（30 molL-1）组。 2.3 羟脯氨酸法 测定胶原蛋白含量 各干预因素处理细胞 48 h 后，取细胞上清液 0.5 mL，加无水乙醇 1.2 mL，旋 涡混匀器充分混匀 2 min，2 次，3 500 rmin-1 离 心 10 min，取上清（约 1.5 mL），烘干，加 0.5 mL 双蒸水复溶，制成稀 释倍数为 1 的检测液， 加试剂 1，2 ， 3（具体见试剂盒说明书），混匀，65 水浴 15 min，冷却后，在 550 nm 波长比色。胶原蛋白含量=7.46羟脯氨酸含量（羟脯氨酸含量占胶原的 13.4%）。羟脯 氨酸=（A 测定管-A 空白管）/ （A 标准管-A 空白管） 标准管浓度稀释倍数。 2.4 胶原合成（ 3H-proline 掺入率）的测定 AFs 接种到 24 孔培养板，贴壁生长至汇 合状态后，更换无血清培养液，继续培养 48 h，使 AFs 处 于 G0/Gl 期。更换新的培养液 （含 0.4%FCS-DMEM 及 0.3 mmolL-1 抗坏血酸），加入上述各 组干预，同时每孔加入 37106 BqL-1 的3H-proline， 共育 30 h 后，0.25% 的胰 酶消化并收集细胞。在 0.22 m的醋酸纤维素微孔滤膜上负压抽滤，生理盐水和 10%的三氯乙酸冲洗滤膜，95% 乙醇 脱色，烘干后置入闪烁瓶中，加入二甲苯闪烁液 4 mL，静置过夜后，在液体闪烁仪计数器 （Tri-carb2300，美国 Packard 公司）上进行放射性强度的测定。 2.5 ELISA 法测定活性 TGF-1及总 TGF-1含量 按 TGF-1免疫检测试剂盒说明书分 别检测细胞培养上清中活性 TGF-1及总 TGF-1含量。总 TGF-1检测样本需经 1 molL- 1 盐酸化 处理；活性 TGF-1检测采用非盐酸化处理的上清液。各组所得结果与对照组进行 对比，进行统计分析。 2.6 总蛋白的提取 取 5105 个各组干预后的心房成 纤维细胞，加入 5 倍体积的裂解 液孵育 20 min，其组成为：Tris-HCl 50 mmolL-1 pH 8.0，NaCl 150 mmolL-1，EDTA 0.5 mmolL-1，DTT 1 mmolL-1， NP-40 1%，脱氧胆酸钠 0.5%，SDS 0.1%，钒酸钠 100 molL-1，PMSF 100 mgL-1，apmtinin 1 mgL-1，leupeptin 2 mgL-1，冰浴条件下 进行组织匀浆，4 ，12 000 rmin-1 离心 10 min，取上清，用 Folin 酚法进行蛋白定量后 保存于-70 。 2.7 免疫印迹法 检测 TSP-1 蛋白表达 取 40 g总蛋白加入上样缓冲液煮沸 3 min 变性， 经 SDS-PAGE 电泳分离蛋白，然后电转移至 PVDF 膜上，封 闭后与 l1 000 稀释的 TSP-1 一 抗 4 孵育过夜，与 11 万稀 释的二抗室温孵育 l h，再与化学发光试剂 ECL 温浴 l min 后 曝光、显影和定影，对结果进行吸光度扫描。用目标蛋白表达量的灰度值除以内参表达量 的灰度值，以所得的比值表示目标蛋白的相对表达量。 2.8 统计学 处理 所有数据均采用AKx-Ds 表示，用 SPSS 12.0 统计软件包进行单 因素方差分析，以 P0.05 为差异具有统计学意义。 3 结果 3.1 STS 对 AFs 胶原含量的影响 0.1 molL-1Ang能显著提高羟脯氨酸含量 （P0.01）。3 ， 10， 30 molL-1STS处理后，羟脯氨酸含量明显减少（P0.01），见 表 1。 3.2 STS 对 AFs 胶原合成速率（ 3H-proline 掺入率）的影响 0.1 molL-1Ang作用 24 h 后，AFs 胶原合成速率较对照组增加至（175.8819.22）% （P0.01），而 3，10，30 molL-1STS处理后能显著抑制 Ang诱导的 AFs 胶原合成速率的增加 （P0.01），见图 1。 XC 杨乐-1.TIF 与对照组相比 1）P0.01；与 Ang组相比 2）P0.05 ，3）P0.01（图 2，3 同）。 图 1 STS 对 AFs 胶原合成速率的影响（ s，n=5） 3.3 STS 对活性 TGF-1及总 TGF-1含量的影响 新近研究表明，循环或局部 Ang 主要通过活化 TGF-1而促心房纤维化。因此，为进一步探讨 STS 抑制 Ang诱导心房成 纤维细胞胶原含量及胶原合成 速率增加的机制，用 ELISA 法检测各组活性 TGF-1（A- TGF-1）及总 TGF-1（T-TGF-1）含量，数据显示 Ang 明显上调 A-TGF-1表达 （P0.01），而对 T-TGF-1表达无明显影响，结果与以往报道一致3。STS 干预后，A- TGF-1表达明 显下调（P0.01 ），见图 2。 3.4 STS 对 TSP-1 蛋白表达的影响 研究表明，Ang 诱导 TGF-1活化的关键因素是 血小板反应素-1（TSP-1）。为证实 STS 抑制 Ang诱导 TGF-1活化的机制，用免疫印迹 法检测各组 TSP-1 蛋白表达， 数据显示 TSP-1 表达被 STS 显著抑制（P0.01），见图 3。 4 讨论 心房颤动（房颤）的发生源于心脏电生理改变和心房结构重塑的共同作用。心房纤维 化会引起细胞外基质沉积与降解失衡，以及成纤维细胞的过度增殖 等。早期研究显示心室 纤维化会引起心室壁进行性硬化，进而引起心室功能不全和充血性心力衰竭。但随后的研 究突出显示了心房纤维化与房颤的关系，与瓣膜病、 高血压和老龄化的关系。调控心房纤 维化也成为临床上治疗房颤患者的重要途径7。然而目前用中草药干预这一过程的研究尚 少。 我国传统中药丹参具有抗缺血缺氧、改善微循环、抑制血小板黏附聚集功能和抗血栓 形成作用， 临床上主要用于冠心病的治疗。但其对心肌纤维化的作用报道较少。 本实验 用培养的新生大鼠心房成纤维细胞研究丹参的主要成分丹参酮A 衍生物 STS 对 Ang诱 导心房成纤维细胞胶原合成的影响，发现 STS 能显著降低 Ang诱导的胶原含量及合成合 成速率上升，但机制尚未完全明了。 研究证明，在心房成纤维细胞，Ang主要通过上调 一些促纤维化的生长因子，间接 促进纤维化，其中最重要是 TGF-1。TGF-1 分为活性和非活性 2 种形式存在，而真正行 使促纤维化效应的是活性 TGF-1。本研究表明，Ang能上 调活性 TGF-1水平而对总 TGF-1水平没有明 显影响，这也与既往研究结果相似，而 STS 处理后能够明显下调活性 TGF-1水平， 说明 STS 正是通过抑制 Ang诱导的 TGF-1活化而降低胶原合成的。 血小板反应素-1（TSP-1）也称凝血酶敏感素-1，是一个相 对分子质量为 450 kD 的同 源三聚体基质糖蛋白，最初发现于血小板 颗粒内，随后被证明可由成纤维细胞、内皮细 胞、血管平滑肌细胞和单核细胞等多种细胞分泌。研究表明，在 Ang活化成纤维细胞 TGF