人工低密度脂蛋白与紫杉醇油酸为胶质母细胞瘤靶向药物递送载体

Z 杂志控释 124 卷，第 3 期 2007 年 12 月 20 日，页 163-171 合成纳米低密度脂蛋白与紫杉醇油酸为胶质母细胞瘤靶向药物递送载体 摘要 低密度脂蛋白（LDL）受体已显示在 GBM 肿瘤细胞中上调 体外 ，因而对治疗剂的递送的潜在分子靶标。一种合成纳米 LDL（ nLDL）粒子是作为通过将亲脂性前体药物，紫杉醇油酸盐，进入粒子靶向 GBM 细胞的药物递送载体。含紫杉 醇油酸酯（nLDL-PO）纳米 LDL 是通过将包含脂质结合基序和低密度脂蛋白受体（LDLR）结合载脂蛋白 B-100 的结 构域，其包括磷脂酰胆碱，甘油三油酸酯，和紫杉醇的脂质乳剂的合成肽构建油酸。紫杉醇油酸盐掺入脂质颗粒的核 心。nLDL-PO 细胞存活在 GBM 细胞系中被发现是时间，浓度和细胞系依赖。细胞杀伤观察短的药物孵化，并在 6 小 时表现出饱和。在 LDL 受体抑制剂，苏拉明的存在 nLDL-PO 细胞存活的提高，这表明该药物是通过 LDL 受体传递。 总的来说，这些数据有力地表明，在合成的纳米 LDL 中可以将亲脂性药物，并且能够杀死 GBM 细胞。nLDL-PO 具有 作为一种选择性药物递送载体用于通过 LDL 受体靶向 GBM 肿瘤的潜力。 关键词 低密度脂蛋白 ; 胶质母细胞瘤 ; 紫杉醇 ; 低密度脂蛋白受体 ; 脂肪乳剂 1。介绍 胶质母细胞瘤（GBM）的是，占近 40的原发性脑肿瘤在成人高度侵略性的恶性肿瘤1 。传统的治疗包括手术后放 疗和化疗有成效有限，中位生存时间为确诊大约为 1 年。尤其是全身化疗交付提供了基本福利到 GBM 患者，其效用受 到质疑2 。药物可施用于患者的量是由高的全身毒性和众多的副作用的限制。一种用于规避与化疗相关的毒性是开发 车辆的选择性靶向上调肿瘤细胞上的细胞受体3 。这样的靶向药物递送载体必须提供高剂量的药物的肿瘤，同时保留 周围的健康组织的潜力。 七 GBM 细胞系的研究显示，这些细胞已上调低密度脂蛋白受体（ LDLR）s 和 128,000 与 950,000 与不同的受体每个 细胞的受体的数量4 。研究 LDLR 的正常大鼠和猴脑组织中的分布表明，正常脑组织，尤其是神经元，具有相对低的 LDLR 数量5 。如此看来，该低密度脂蛋白受体是选择性递送的抗肿瘤化合物的 GBM 一个潜在的分子靶标。 有人曾建议血浆衍生的 LDL，对于 LDLR 的主要配体，可作为药物递送系统的肿瘤表达 LDLR 6 和 7 。LDL 是一 种疏水性的脂质，主要是胆甾醇酯与少量的三酸甘油酯，它可用于亲脂性药物掺入的芯组成的 22-27 纳米的颗粒。表 面由磷脂，未酯化胆固醇和载脂蛋白 B-100（载脂蛋白 B）的一个分子的8 。载脂蛋白 B 是 550000 沓糖蛋白具有 9 个氨基酸（残基 3359-3367），其作为用于 LDL 受体的结合结构域10 。结合后在网格蛋白小窝的低密度脂蛋白受体， LDL 是通过细胞内吞作用和动作内化入其中 pH 值下降会导致受体的 LDL 解离核内体。该受体被再循环回到细胞表面， 而 LDL 被移动到那里的粒子被降解溶酶体10 。 在以前的研究中，抗癌药物已被直接地加载到血浆 LDL 11或 LDL 的脂质核心分别代替药物12 ，13 ，14，15 ， 16 ， 17 ， 18 和 19。天然 LDL，虽然是不太理想的作为靶向剂，因为它是难以大量地分离，并且是可变的成 分和尺寸。另一种方法中使用的重构的 LDL 由含药物的稳定的脂质乳剂的纯化载脂蛋白 B 20，21 ，22 和 23 。 的载脂蛋白 B 蛋白，然而，是难以分离，由于其大尺寸和聚集倾向，因此不用于产生重组的 LDL 的大批量有用。 最近的研究表明创建一个合成的 LDL 颗粒的可行性。两个这样的研究，开发了一种合成的 LDL 颗粒作为替换为血清中 的细胞培养基用脂质乳剂和载脂蛋白 B 的低密度脂蛋白受体结合结构域组成的肽24 和 25 。这种合成的颗粒能够通 过经 LDL 受体交付胆固醇的细胞，支持细胞生长。在另一种方法中，我们最近描述的合成纳米颗粒的 LDL（nLDL）， 作为治疗 GBM 一个潜在的药物递送载体 26 。该 nLDL 是由脂肪乳剂和一种独特的双功能肽，其包含脂质结合结构域 和 9 个氨基酸的 LDLR 结合结构域。我们的新 nLDL 模仿的血浆提取低密度脂蛋白的行为，并能针对低密度脂蛋白受 体的 GBM 细胞的。该颗粒的脂质核心有把亲脂性的细胞毒性药物的潜力，但是这尚未得到证实。 本研究的目的是要表明，我们的合成 nLDL 可以在文化传递的亲脂毒性抗癌药物的有效载荷，以 GBM 细胞。紫杉醇的 亲脂性衍生物，紫杉醇油酸酯（PO） 27 ，被用来作为一个试验药物。这样的前药通过破坏所需的细胞分裂的正常微 管动力学导致细胞死亡28 。我们表明，合成的纳米 LDL 装载紫杉醇油酸酯（ nLDL-PO）进入细胞通过低密度脂蛋白 受体，并能够在培养杀死 GBM 细胞。 2。材料和方法 2.1。物料 三油精（TO），胆甾醇油酸酯（CO），紫杉醇，油酰氯，乙腈，三氟乙酸（TFA ），丁基化羟基甲苯（BHT），和 1无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）购自 Sigma 公司。最小必需培养基（MEM），胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶- EDTA 是从加州大学旧金山分校细胞培养设备获得的。Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM）购自 Invitrogen 公司 获得的。苏拉明从 AXXORA，LLC （圣地亚哥， CA）获得。蛋黄磷脂酰胆碱（PC）中的自 Avanti 极性脂质获得的。 脂蛋白缺乏血清（LPDS）从 Intracel（弗雷德里克，MD）获得。用于生产 nLDL-PO 的 29 个氨基酸的肽被前面描述 的26和肽从生物合成公司（路易斯维尔，TX ）获得的在大于 95的纯度通过 HPLC 分析测定的。 2.2。紫杉醇油酸酯的合成 紫杉酚（100 毫克，0.117 毫摩尔）加入到 10 mL 的火焰干燥的圆底烧瓶中，并在惰性气氛（氩气）下放置。干燥氯 仿溶液中加入（1 毫升），并将反应冷却至 0。几分钟后 1.3 当量的油酰氯（50.3 微升，0.152 毫摩尔），接着加入 三乙胺（20.8 微升，0.152 毫摩尔）。将反应维持在 015 分钟，然后温热至室温。在室温下 4 小时后，将反应混合 物稀释，用 5 毫升氯仿中，将有机层依次用 10碳酸氢钠水溶液（5mL）中。除去有机层，水层用氯仿（25 毫升） 萃取两次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并除去溶剂。将粗残余物溶解于 250L 的 1甲醇/氯仿，并使用由 100 毫升 1甲醇/ 氯仿，100mL 的梯度溶剂系统通过快速柱色谱（硅胶 25g，用 Whatman 60 埃,230-400 目）进行纯 化 1.5甲醇 /氯仿和最后 2甲醇/氯仿，直到完全洗脱产物。鉴定通过薄层色谱级分含有紫杉醇油酸盐（RF 0.37，3甲醇 /氯仿，玻璃背硅胶板 Analtech Uniplate 钢板，250 微米厚，5 厘米10 厘米，4mm 时，荧光指示剂 254nm 的用 UV ）并合并，得到 119 毫克无色泡沫（91 收率），将其在使用前在真空下彻底干燥。该产物的身份通 过在 Bruker 的 Avance 300 MHz 核磁共振仪（加州大学伯克利分校）核磁共振和通过在 Finnigan LCQ 双核仪器质谱 验证。 2.3。药物定量 反相高效液相色谱法（HPLC）协议的开发是为了量化紫杉醇和紫杉醇油酸盐中的乳剂和合成纳米 LDL。样品上附着在 Perkin Elmer 200 系列高效液相色谱机器和吸光度月神 5C-18 分析柱（2504.6 毫米的 Phenomenex）执行读取 227 纳米（珀金埃尔默 200 系列紫外/可见光检测器）。紫杉醇油酸盐洗脱含 0.05TFA 的乙腈以 1.0 毫升/分钟的流速， 并且具有约 11 分钟的柱保留时间。紫杉醇，另一方面，洗脱用 0.05TFA 的 50:50 的乙腈 - 水，以 0.5 毫升/ 分钟的 流速，并且具有约 25 分钟的柱保留时间。峰下面积采用数值积分（辛普森法则）计算。标准曲线是使用溶解在甲醇中 已知量的紫杉醇和紫杉醇油酸盐的开发。 2.4。生产合成纳米低密度脂蛋白与紫杉醇油酸（nLDL-PO ） 脂肪乳剂形成如前所述26 。乳液包括 PC 和在 3:2 的摩尔比（PC：11.25 毫克，TO：8.73 毫克）。紫杉醇油酸盐溶 解在甲醇中，并添加到初始的脂质混合物。脂质和药物进行了氮气下干燥。tris-盐水缓冲液（6 毫升，20 毫摩尔 Tris，pH 7.2）中导入干燥的脂类和药物，并且然后将溶液旋涡处理在低设置 1 分钟。将该溶液超声处理（布兰森洗净 器，索尼）为 35 分钟，在设定 3，在冰上，以破坏较大的脂质复合物。超声处理的颗粒进行纺丝，20 分钟，以 3000rpm 的转速，以除去颗粒和未结合的药物。使用如前面所描述的阿凡提极性脂质挤出脂质乳剂挤出26和最终的乳 液过滤通过 0.22 微米过滤灭菌。乳液与药物结合在 2.15 微米（1.27 毫克 /毫升）的合成肽。将混合物轻轻涡旋混合 1 分钟，然后孵育 30 分钟，在室温下进行。未结合的肽除去透析的 Tris-生理盐水缓冲液，在 4，在 24 小时的时间间 隔两个变化。 2.5。组成和颗粒大小 粒子的脂质成分，使用从光（里士满，弗吉尼亚州）的酶比色测 定法测定甘油三酯和磷脂。蛋白定量的马克韦尔方法 29 。紫杉醇油酸盐和紫杉醇浓度通过如上所述的反相 HPLC 测定。nLDL-PO 来自三个独立实验的组合物进行了测定 脂质和蛋白组成的可重复性。 颗粒的大小由负染色电子显微镜如前所述测定30 。 2.6。细胞培养 HeLa 细胞得自 ATCC 并培养在 DMEM 培养液含 10FBS（37 ，5CO 2）。GBM 细胞系（SF-767，U-251，SF- 763）是从脑肿瘤研究中心（加州大学旧金山分校，加利福尼亚州）的组织库取得及所描述的卡拉汉生长本质11在老 鹰的最低必需培养基（MEM）的补充有 1非必需氨基酸，1g / L 的葡萄糖， 0.292 克/ L 谷氨酰胺，2.2 g / L 的碳酸氢 钠和 10胎牛血清。 2.7。荧光显微镜 为研究确定的摄取荧光标记的颗粒，细胞铺板在 510 4，每孔的细胞在实验室康 II，2 -孔室玻片。允许细胞脂蛋白缺 乏的胎牛血清（LPDS）在上述 MEM 被放置于细胞之前生长 48 小时。实验是成倍增长的细胞，在大约 70汇合，除 了 LPDS 媒体 24 h 后进行的。在每个实验结束时，将细胞用 PBS 含 1无脂肪酸 BSA 洗涤两次。 细胞固定在 PBS 中的 4多聚甲醛中 15 分钟，在室温下 PBS 中漂洗后。荧光显微镜进行了使用蔡司 200M AXIOVERT 光学显微镜。数字图像被捕获的图像专业软件。荧光图像在 40的放大倍率获得的。 2.8。直接成像显微镜 之前和之后添加 nLDL-PO 的活细胞上观察蔡司 200M AXIOVERT 光学显微镜。数字图像被捕获的图像专业软件。 2.9。nLDL-PO 毒性的测定 以确定细胞毒性暴露于 nLDL-PO，将细胞在 96 孔板（Nunc 公司）的 200L 的媒体铺板于 2500 个细胞/ 孔。允许细胞 脂蛋白缺乏的胎牛血清（LPDS）在上述 MEM 或 DMEM 被放置于细胞之前生长 48 小时。实验是指数生长的细胞中， 在大约 40汇合时，除了 LPDS 媒体的 24 小时后进行了。 在每个实验结束时，将培养基从细胞中除去和新鲜的培养基 100L 的比例添加。该 CellTiter96 非放射性细胞增殖测定 法（Promega）中，使用根据制造商的指示来量化细胞的存活。吸光度在同一天被读取 570 nm 处的分子器件光谱最大 340 酶标仪。为了确定的细胞存活，吸光度值标准化抵销收到的 Tris-缓冲盐水同等音量控制井。细胞存活的作图 （ -轴）对药物浓度（ x 轴，对数的底数 2 级）。在 IC 50，这是为了杀死半数细胞所需的浓度，进行测定。 2.10。统计 学生的 吨 检验（双尾）用于测定 IC 之间显著差异 50或在实验药物浓度。 P -值小于 0.05 被认为是显著。 3。结果 3.1。nLDL-PO 表征 我们以前表明，合成的纳米 LDL 配制的磷脂酰胆碱的摩尔比（PC）：三油酸甘油酯（TO）：（CO）3 点 02 分 01 秒 的胆固醇油酸酯包含在最终只有一小部分的 CO（3）产品26 。因此，我们测试了 CO 在乳剂是否有必要为 PO 掺 入 nLDL，发现 CO 的存在或不存在对 PO 结合（数据未显示）没有影响。因此，胆固醇油酸酯被排除在今后所有的乳 液配方。 以确定最佳的药物浓度对于生产含药乳液，PO 加入到初始的脂质混合物（ PC：TO，3:2）在不同浓度（0.083-0.67 毫 克/毫升）和 PO 的掺入量为量化，如图 所示。1 A。紫杉醇油酸掺入出现饱和周围 0.33 毫克/ 毫升 PO 它产生的 PO 48.56.5，回收率在最后的乳液，所有进一步的研究进行了在这个 PO 浓度。在乳剂的制造中，观察并溶解在甲醇中 在玻璃上超声处理管的壁中的残基。甲醇的样品通过 HPLC 运行和 PO 的量进行定量。它被确定 PO 没有结合到乳液 中已经吸附在玻璃上。以确定是否有在 PO 与非衍生紫杉醇的掺入有差别，乳液与任何紫杉醇或紫杉醇油酸等摩尔量 进行。紫杉醇油酸盐示范显著更大的掺入比紫杉醇（脂质乳剂 P = 0.004）。 图。1 乙演示中掺入紫杉醇油酸盐相比， 紫杉醇与紫杉醇的衍生化的增加的亲脂相一致的 4 倍增加。 图。1。 紫杉醇油酸纳入脂肪乳剂。a）注册成立的 PO 在一个范围 0.083-0.67 毫克/ 毫升到乳液; 饱和度约发生 0.33 毫克/ 毫升的采购 订单。B）紫杉醇与紫杉醇为油酸脂乳液的掺入，PO 的初始金额为 0.3 毫米。药品注册成立肽结合的 C）的影响; 2.15 微米 （1.27 毫克/毫升）肽使用。肽对 PO 注册成立四）影响。紫杉醇油酸盐和紫杉醇浓度通过反相 HPLC 定量。每个数据点代 表三个单独生产的乳液的平均值SD。的水平栏表示由发现显著差异 吨 测试。 图选项 该 nLDL-PO 的最终制剂（重量）为：肽， 286，PC，402; 于，267; 和 PO，61（ = 3）。以确定是 否 PO 的存在改变了肽结合到乳液中，乳液具有和不具有 PO 的肽含量进行评价。如见于 图。1 C，PO 的存在不影响 该肽结合到乳液的能力。另外，通过添加肽含有 PO 乳剂没有显著影响乳液（中的药物含量 图 1D）。总而言之，这些 结果表明，PO 结合到颗粒的核心。 该 nLDL-PO 颗粒电子显微镜显示，他们主要是圆形， 8-15 纳米直径的颗粒。 3.2。nLDL-PO 在 SF-767 细胞摄取 之前我们已经表明，如果没有药物的合成 nLDL 由 GBM 细胞培养内化26 。要验证加载 nLDL 与 PO 不会改变粒子的 吸收，FITC 标记的 nLDL-PO 颗粒培养与 SF-767 GBM 细胞系在 37前 3 小时（1.5 微米肽在 200 微升的媒体）荧光 显微镜。如见于 图。2 A，FITC 标记的 nLDL-PO 是由 SF-767 细胞内化。 图。2。 的 nLDL-PO 和细胞杀伤通过 nLDL-PO 细胞摄取。A ）FITC 标记 nLDL-PO 的细胞摄取的代表图像。左：细胞的明场图像， 中东：通讯 FITC 标记 nLDL（1.5 微米肽），右的荧光图像：FITC 标记的肽相应的荧光图像与细胞核用 DAPI 染色合并。 B）在 nLDL-PO 细胞杀伤 HeLa 细胞。该 IC 50为 6.5 微米（24 小时）和 0.7 微米（72 小时）为 nLDL-PO。C）细胞由 nLDL-PO 杀 SF-767 细胞。该 IC 50为 7.9 微米（24 小时）和 3.6 微米（72 小时）为 nLDL-PO。数据代表了三个不同的孔 的平均值标准差。这些实验重复与单独导出 nLDL-PO，取得了类似的结果。 图选项 3.3。与 HeLa 细胞和 SF-767 细胞的毒性研究 以前的工作由 Lundberg 等人27表明，装有油酸紫杉醇脂质乳剂能有效杀灭 HeLa 细胞培养。我们利用这些细胞，与 GBM 细胞系 SF-767 一起，以确定合成纳米低密度脂蛋白装有 PO 是否可以杀死细胞的培养。在图 2 B-C，这两个细 胞系暴露于用于评估可达 72 小时，细胞存活的范围 PO（0.63-20 微米）的。很明显，细胞杀伤与 nLDL-PO 是时间和 浓度依赖性，其中 72 小时暴露是显著大于在每一种情况下 24 小时。在 72 小时后，将集成电路 50对 HeLa 细胞为 0.7M 相比，3.6M 为 SF-767 细胞。在两种细胞系中，nLDL-PO 证明显著更大的细胞杀伤作用比单独 PO。这些结 果表明，nLDL-PO 可以杀死细胞，并比单独的药物更有效。 要验证细胞的杀伤，而不是细胞的生长迟缓，发生，直接图像显微镜使用（ 图 3）。引入 nLDL-PO 之前，健康 SF- 767 细胞被看作簇梭形细胞（ 图 3 中的 A）。温育不含药物 72 小时的对照细胞显示细胞表示细胞的持续增长（的紧密 堆积的单层 图 3 的 B）。 图。3 一个 72 小时的温育与 nLDL-PO（20M 和 5M 的 PO，分别）之后的 C-D 显示细胞。 在药物浓度较高时，几乎所有的细胞都死了，而在低浓度少数细胞似乎都活了下来。孵育单独紫杉醇油酸酯（5M） 或 nLDL 无药物（8M 肽）72 小时额外的细胞，表现出细胞的紧密堆积的单层（数据未示出），类似于对照细胞没有 药物。 图。3。 SF-767 细胞的前孵育 nLDL-PO 后直接图像照片。细胞培养在 96 孔板中孵育 nLDL-PO 之前 72 小时。A ）紧接孵化与药物 细胞，B）在没有 nLDL-PO 的 72 小时生长的细胞，细胞融合。C）细胞后 72 h 后用 20 微米 nLDL-PO，只有小圆形死细胞 均可见，D）细胞后 72 h 后用 5 微米 nLDL-PO。细胞的数量被大大减少相比，“B” 和只有少数细胞似乎是可行的。图片拍摄 于一个 10的放大倍率。在右下角栏标记表示约 110 微米。 图选项 为了模仿临床药代动力学，用快速药物消除，将细胞脉冲孵育 nLDL-PO 为 1，3，6，12 ，24，或 72 小时之后，洗涤 细胞并培养在无药物培养基中的 72 小时总孵化时间。集成电路 50（ 图 4）减少为培养时间与 nLDL-PO 增加，但是 6 和 12 小时（集成电路之间的相同 50 10M）。IC 50 12 小时和 24 小时之间的降低，但为 24 和72 小时之间是相同的 （IC 50 3M）。在 IC 初始高原 50于 12 小时显示饱和度在药物的吸收，这是受体介导的摄取低密度脂蛋白受体的特 征。所有其他的细胞进行了研究，用更短的孵育时间与 nLDL-PO（即 3 小时或 6 小时）。 图。4。 时间和浓度对 SF-767 细胞杀伤通过 nLDL-PO 的影响。细胞暴露于 nLDL-PO（0.08-20 微米的药物）的时间 （1，3，6，12，24，72 h）本 nLDL-PO 被删除后，没有药物的新鲜培养基可变长度，加入细胞对于一个 72 小时总孵化。 该 nLDL-PO 浓度在其中 50的细胞存活观察（IC 50值）分别为：20M（1 小时），13.3M（3 小时），9.9M（6 小时）， 9.8M（12 小时），3.5M （24 小时），和 3.4M（72 小时）。数据代表在同一试验内三次重复的平均值 标准差。此实 验重复与单独衍生批次 nLDL-PO，并且得到相似的结果。 图选项 3.4。nLDL-PO 需要摄取低密度脂蛋白受体 我们先前的研究显示26认为 nLDL 摄取阻断低密度脂蛋白受体抑制剂，苏拉明31 。以证明通过 LDLR 发生的药物递 送，细胞用 10MnLDL-PO 加苏拉明（10 毫米），用于除去后两种化合物和新鲜培养基而不 nLDL-PO 和抑制剂溶液 中加入额外 69 H 3 小时潜伏期（共 72 个小时的培养）。 图。5 表明，细胞杀死了显著（ P = 0.001），效率较低 （51 存活），当 LDLR 被阻断与苏拉明相比无苏拉明（12存活）的控制。后者的支持，该药物通过低密度脂蛋白 受体进入细胞的前提。 图。5。 苏拉明对 nLDL-PO 细胞杀伤效率的影响。nLDL-PO（10M）加入到 SF-767 细胞有和没有 10mM 的苏拉明 3 小时的 nLDL-PO 和苏拉明除去之后;新鲜培养基而不药物加入到细胞中的 72 小时总孵化。数据代表了三个不同的孔的平均值 标准 差。此实验重复与单独衍生批次 nLDL-PO，并且得到相似的结果。的水平栏表示由发现显著差异 吨 测试。 图选项 3.5。细胞的存活与 SF-767，SF-763 和 U-251 细胞的比较 这是以前观察到不同的 GBM 细胞系中有每个细胞 LDL 受体的数量可变的4 。为了确定细胞受体数量是否会影响细胞 的杀伤通过 nLDL-PO，三 GBM 细胞系 SF-763，SF-767 和 U-251 细胞有 950,000，288,000，128,000 和每个受体细 胞，分别进行了检查。细胞与不同浓度的药物（0.08-20 微米）的用于除去药物后 6 小时和新鲜的培养基没有药物溶液 中加入 66 小时温育（ 72 小时总孵化）。 图。6 表明，在 IC 50值分别为：SF-763，2.2 微米，SF-767，7.5 微米，和 U-251，6.9 微米。有显著差异（ P 0.05）之间的 IC 50相比，SF-767 和 U-251 细胞其中 SF-763 细胞更敏感的药物为 SF-763。在 IC 之间未观察到细胞的杀伤无差异 50 SF-767 和 U-251 细胞。 图。6。 （：，：288,000，和 U-251：128,000 感受器每个细胞 SF-767 950,000 SF-763）nLDL-PO 对表达不同的低密度脂蛋白受 体数目 3 GBM 细胞株存活率的影响。细胞与 nLDL-PO 为除去 nLDL-PO 后 6 小时和新鲜培养基而不药物加入到细胞中的 72 小时总孵化。数据代表了三个不同的孔的平均值标准差。此实验重复与单独衍生批次 nLDL-PO，并且得到相似的结果。 图选项 4。讨论 高级别胶质瘤难以治疗，因为他们成长积极和细胞胰岛经常保持肿瘤手术切除后。这些残余细胞导致肿瘤复发。近年 来，重点用于治疗神经胶质瘤，以及其他类型的肿瘤，已经成为特定分子靶的鉴定用于药物递送。这样的分子靶点可 以最大限度地减少对周围正常组织的毒性作用。表皮生长因子受体32 ，血小板衍生生长因子受体 33 ，成纤维细胞生 长因子受体34 ，人类表皮受体 2 型 35 ，和白细胞介素 13 受体的36已被证明是向上在胶质瘤细胞调控。而 LDL 受 体是稀疏正常脑组织5 ，我们曾表明，人类 GBM 细胞系表达高水平的 LDL 受体4 ，这表明 LDL 受体可能代表一个 唯一的目标，可用于直接交付化疗药物对肿瘤细胞的对流增强交付技术37 。而血脑屏障（BBB ）可能拥有的 LDL 受 体，可以发挥内吞或 transcytose 低密度脂蛋白38，39 和 40，GBM 肿瘤缺乏 BBB 2 和 41 。其中内皮细胞 中的健康组织的 BBB 将受到由 LDL 受体的程度靶向治疗是未知的。我们已经使用双功能肽，其具有与 LDL 受体结合 结构域连接到一个 18 个氨基酸的两亲性 -螺旋先前生成的合成纳米 LDL 26其中目标上的 GBM 细胞系中的低密度脂 蛋白受体。我们目前的做法是，以确定是否 nLDL 可以将脂溶性药物的有效载荷，如果这种药物运载工具可以杀死 GBM 细胞系。紫杉醇油酸盐，紫杉醇的亲脂衍生物，被用来作为模型药物。 紫杉醇促进微管蛋白的聚合。形成在紫杉醇的存在下，微管是非常稳定和功能失调，从而引起细胞死亡通过破坏所需 的细胞分裂的正常微管动力学。紫杉醇已证明在原发性上皮性卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，头颈部，非小细胞肺癌，与 艾滋病相关的卡波氏肉瘤的治疗抗癌活性28 。虽然紫杉醇表明承诺在为胶质母细胞瘤的临床前研究，它是无效的在 全身输送应用2 和 42 。这些问题都与紫杉醇的溶解性差并且它无法穿过血-脑屏障相关联43 。直接配送方式，如 对流增强交付，表明承诺在提高药物的有效性在脑肿瘤44 ，但紫杉醇治疗是通过药物的毒性仍然仅限于健康组织。 尽管我们的制剂的 nLDL-PO 是对 HeLa 细胞的毒性较低（IC 50：700 纳米， 72 小时）比标准的 Cremophor EL：乙醇 紫杉醇制剂（IC 50：50 纳米，48 小时）27，nLDL-PO 中与直接交付方式组合可能导致药物在脑肿瘤细胞的高与积累， 因为它的目标是优先表达于 GBM 细胞的低密度脂蛋白受体的能力，周围的健康组织减少损伤。 目前的研究已经证明加载脂溶性药物到 nLDL 的可行性，并表明，该递送载体可以杀死 GBM 细胞。紫杉醇的毒性，但 是，依赖于细胞的分裂和许多细胞在不断增长的脑瘤不积极分裂45 ，46 和 47 。因此，紫杉醇可能不是最佳的药 物治疗这些肿瘤。细胞毒性药物，而非细胞周期依赖性可能为靶向药物递送载体更好的有效载荷。在这方面，亲水性 药物可以通过化学修饰的建议转化为疏水性药物前体由几个实验室15 ，16 和 27，从而增加了药物可以通过 nLDL 被潜在地靶向 GBM 的军火库。 紫杉醇油酸盐，最初是由伦德伯格等人描述。27 ，被掺入到脂质乳剂。类似的方法被用来罗德里格斯等人 48 。这一 提法被认为是获得载脂蛋白 E（apoE 基因），其中结合的 LDL 受体。然而，载脂蛋白 E 另外结合到低密度脂蛋白受 体相关蛋白（LRP），这是由神经元在整个大脑表达49 。因此，这种制剂，不同于我们的粒子，没有特别的靶向肿瘤 细胞，并可能会导致大量的正常脑组织的非特异性摄取和不良的副作用。 在目前的研究中，我们已经表明，nLDL 保留了其对目标 LDLR 能力，尽管加入紫杉醇油酸酯的制剂。我们观察到在 IC 中的高原 50 6 和 12 小时的温育与 nLDL-PO 之间的值。这一结果与我们以前的研究相一致26 ，其中荧光标记 nLDL 吸收在 6 小时时间点饱和。摄取的这种饱和指示的受体介导的过程。的低密度脂蛋白受体抑制剂，苏拉明，由 Schneider 等所示的存在 31由低密度脂蛋白受体阻断 LDL 摄取，显著随 nLDL-PO 验证需要的官能 LDLR 的高效细胞 治疗的 SF-767 细胞的细胞存活杀戮。这些结果与我们以前的研究相一致 26 ，其中荧光标记 nLDL 针对性的低密度脂 蛋白受体和吸收阻断苏拉明。在这些研究中，我们也能证明 nLDL 可以阻止血浆来源的 LDL 结合，并通过低密度脂蛋 白受体摄取，进一步证实了 nLDL 通过低密度脂蛋白受体进入细胞。由于 nLDL-PO 目前的研究显示，以行为类似于 nLDL 没有药物，这是一个迹象表明，尽管另外的药物，nLDL 保留对目标 LDLR 的能力。 低密度脂蛋白受体的在我们的研究中测试的 GBM 细胞株数量从 128,000 至 950,000 元细胞，其中 SF-763 细胞，其中 有受体的人数最多，展出最贫穷的细胞存活与它的高受体的数量一致。在 U-251 细胞系与受体 128,000 每个细胞和 SF-767 与 288,000 感受器每个细胞拥有相等的生存和生存期大于 SF-763 细胞。这些结果与我们以前的研究，我们注 意到的是摄取荧光标记 nLDL 颗粒是依赖于低密度脂蛋白受体的数量在细胞表面的对比26 。细胞杀死，但是，是与其 它因素，如细 胞对药物和药物抗性转运蛋白，可以从细胞中除去药物的敏感性的药物既吸收的功能;因此，它是不足为 奇的细胞存活率为不完全依赖于低密度脂蛋白受体数目。 血浆 LDL 和 HDL 颗粒不会在脑脊髓液中发现5 和 50 ，因为它们不穿过血-脑屏障。全身递送 nLDL 的将限制微粒 的有效分配，但是该颗粒可以通过对流增强的递送技术直接作用于肿瘤的区域被传递37 。与我们的双功能肽形成 nLDL 颗粒小（8-15 纳米），因此它很可能是它们的扩散会比血浆 LDL（25 纳米）或由伦德伯格描述的50nm 的 颗粒更优化的27 ，由于存在颗粒尺寸及其在组织中的扩散之间的反比关系。与直接注入大脑脂质体的研究 在体内 51 和 52 ，间隙时间可短至数小时，长则数天。目前的研究表明，缩短培养时间与 nLDL-PO 到几个小时，而不是天， 将导致在培养细胞的杀伤细胞。后者表明，nLDL-PO 可能是一种有效的运载工具无论过关时间发生 在体内 。合成 nLDL 因而似乎是一个有前途的药物传递载体靶向亲脂性抗癌药物对 GBM。 合成 nLDL 技术不限于 GBM 疗法。提高低密度脂蛋白的要求和受体活性已被观察到在结肠癌53 ，前列腺癌54 ，肾 上腺肿瘤55 ，激素反应迟钝乳腺肿瘤56 ，妇科起源的癌症57 ，肺肿瘤组织 58和白血病59 和 60。虽然投机， 这些癌症都可能是 nLDL 装有化疗药物治疗。此外，LDL 受体已在增殖的内皮细胞中观察到61 。抗血管生成剂可以 靶向使用 nLDL 防止肿瘤生长的内皮细胞。可替换地，用于治疗组织损伤以下损伤或手术，治疗促进伤口愈合可以加载 到 nLDL 到目标血管内皮细胞。总之，合成 nLDL 似乎是一个有前途的药物传递载体通过低密度脂蛋白受体靶向治疗药 物的亲脂性细胞。 致谢 作者要感谢儿子何和 Terren 特洛特为这个项目提供技术援助，并埃莉诺布莱克利博士利用她的细胞培养设施和荧光显 微镜。这项研究是由儿童医院奥克兰研究所机构性基金的支持。 参考文献 1. o 1 o 答：那拉亚那，SA 利贝尔 o SA 利贝尔， TL 菲利普斯（合编），放射肿瘤学，爱思唯尔公司，费城，宾夕法尼亚（ 2004）的教科书，页 463-495 o 2. o 2 o JM 马克特，VT 德维塔，S.赫尔曼，SA 罗森伯格 o 胶质母细胞瘤 o 琼斯和巴特利特出版社，波士顿，马萨诸塞（2005） o 3. o 3 o P. 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