内毒素知识介绍.

内毒素知识介绍 内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。 内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。 内毒素不是蛋白质，因此非常耐热。在 100的高温下加热 1 小时也不会被破坏，只 有在 250的温度下加热 1 个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸 30 分钟才能破坏 它的生物活性。与外毒素不同之处，还有：内毒素不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒素； 把内毒素注射到机体内虽可产生一定量的特异免疫产物（称为抗体） ，但这种抗体抵消内毒 素毒性的作用微弱。 内毒素脂多糖分子由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质 A 三部分构成。脂质 A 是内毒素的主要毒性组分。不同革兰氏阴性细菌的脂质 A 结构基本相似。因此，凡是由 革兰氏阴性菌引起的感染，虽菌种不一，其内毒素导致的毒性效应大致类同。这些毒性反 应主要有： 发热反应。人体对细菌内毒素极为敏感。极微量（1-5 纳克/公斤体重）内毒素就能引 起体温上升，发热反应持续约 4 小时后逐渐消退。自然感染时，因革兰氏阴性菌不断生长 繁殖，同时伴有陆续死亡、释出内毒素，故发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。 内毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞等，使之产生白细胞介素 1、6 和肿瘤坏死因子 等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体 温升高发热。 白细胞反应。细菌内毒素进入宿主体内以后，血流中占白细胞总数 60-70%的中性粒细 胞数量迅速减少，这是因为细胞发生移动并粘附到组织毛细血管上了。不过 1-2 小时后， 由内毒素诱生的中性细胞释放因子刺激骨髓释放其中的中性粒细胞进入血流，使其数量显 著增加，有部分不成熟的中性粒细胞也被释放出来。革兰氏阴性菌的伤寒沙门菌是例外， 其内毒素使白细胞总数始终是减少状态，目前还不清楚是什么原因。由于绝大多数被革兰 氏阴性菌感染的患者血流中白细胞总数都会增加，所以现在医生在诊断前，为了初步区别 是细菌性感染还是病毒性感染，常常要化验病人的血液，对白细胞进行总数测定和分类计 数。被病毒感染的病人，其白细胞总数和中性粒细胞百分比基本在正常值范围内。 内毒素血症与内毒素休克。当病灶或血流中革兰氏阴性病原菌大量死亡，释放出来的 大量内毒素进入血液时，可发生内毒素血症。大量内毒素作用于机体的巨噬细胞、中性粒 细胞、内皮细胞、血小板，以及补体系统和凝血系统等，便会产生白细胞介素 1、6、8 和 肿瘤坏死因子 、组胺、5 羟色胺、前列腺素、激肽等生物活性物质。这些物质作用于小血 管造成功能紊乱而导致微循环障碍，临床表现为微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等， 于是导致病人休克，这种病理反应叫做内毒素休克。 关于内毒素休克，过去曾有过惨痛的教训。20 世纪 40 年代青毒素刚问世的时候，医 生发现青霉素对脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑膜炎疗效非常显著。因此，凡发现这类病人， 一律优选青霉素进行治疗；且按照一般规律，用药剂量随病情严重程度而递增。结果发生 了意外，用大剂量青霉素治疗重症脑膜炎患者时，不少发生了内毒素休克而死亡。后来经 过研究分析，发现了其中的原委。病情严重的患者，体内存在的病原菌数量多，医生采用 大剂量“轰炸”，意欲“ 一举歼敌 ”。快速、彻底杀灭病原体，这种战略无可非议，但有些医 生忽略了另一方面，即流行性脑膜炎的病原菌是属革兰氏阴性菌的脑膜炎奈瑟菌，其致病 物质是内毒素，而内毒素是要在病菌死亡后再放出的。如今用大剂量青霉素一下子将全部 病菌杀死，也就是使大量内毒素一次放出，促成了内毒素休克，加速了患者的死亡。随着 医学的进步，现在医生遇到这类病人，一方面仍然要用大剂量的有效抗菌药物去对付，同 时要加用激素类药物，以保护对内毒素敏感的细胞不对内毒素诱生的细胞因子发生反应， 从而度过“休克 ”难关。犹如外科手术时，采用麻醉药使病人丧失痛觉一样。 内毒素或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在酒精性肝病（ALD）所致的肝损害中起 重要作用1。 LPS 要发挥生理作用，必须与血循环中的载体结合，脂多糖结合蛋白 （lipopolysaccharide binding protein, LBP）是近年发现的一种 LPS 载体蛋白，它能与 LPS 结合形成 LPS-LBP 复合物，并将 LPS 运送到效应靶器官或靶细胞发挥生理或病理生理作 用。单核/巨噬细胞表面存在一种膜蛋白 CD14，其分子量为 5.5104，主要功能是识别 LPS，被认为是 LPS 的受体，在 LPS 介导单核/ 巨噬细胞激活中起重要作用 2。LPS-LBP 与 CD14 的结合能促使单核/巨噬细胞激活并释放多种细胞因子，诱导肝脏损害3。 LPS、LBP 及 CD14 三者在 ALD 中的确切作用机制及相互关系尚不清楚。本研究用乙醇喂 养大鼠建立酒精性肝病动物模型，观察 LBP 和 CD14 mRNA 的表达及其在肝损害中的作用。 结 果 1. 血中内毒素和 ALT 含量变化：乙醇喂养组大鼠喂养 4 周和 8 周时血浆 LPS 浓度分 别为(12921) pg/ml 和（18735 ）pg/ml, 明显高于对照组的（489）pg/ml 和（5311） pg/ml（ t 值分别为 11.2 和 11.6，P0.05） ；乙醇组血清 ALT 浓度分别为（11215）U/L 和 （14722）U/L，也明显高于对照组的（3112）U/L 和（339）U/L（t 值分别为 5.9 和 20.6，P0.05)。 2. 肝组织中 LBP 和 CD14 mRNA 的表达：两组大鼠肝组织中 LBP 和 CD14 mRNA 的 表达见图 13。对照组大鼠 4 周和 8 周肝组织中 LBP 和 CD14 mRNA 的表达均不明显。 乙醇喂养组大鼠肝组织中 LBP 和 CD14 mRNA 在 4 周时已明显表达， 8 周时表达进一步增 加，其中 CD14 mRNA 表达最显著，与对照组相比差异有显著性（P0.05） 。 3. 肝脏形态学变化：对照组大鼠光、电镜下肝组织无明显的病理学变化。乙醇喂养组 4 周时光镜下见肝细胞内出现大小不等的空泡样变性，肝窦内有较多白细胞，但未见明显 的炎性细胞浸润和坏死病灶形成；乙醇喂养 8 周后，肝细胞脂肪变性更加明显，并有较多 的炎性细胞浸润及坏死灶出现（图 4、5） 。电镜下乙醇喂养组肝细胞内有较多局灶性的胞 浆变性及髓鞘样结构形成，并可见坏死灶的出现（图 6、7） 。 讨 论 酒精性肝病时肝脏损害的程度与乙醇的剂量和作用时间呈正相关，雌性大鼠比雄性大 鼠对乙醇具有更高的敏感性，甘氨酸通过减少胃内乙醇的吸收预防酒精所致的肝脏损害。 然而，其确切的机制尚不清楚。乙醇对肝脏的毒性作用与血浆中内毒素的水平密切相关 1，2，内毒素或 LPS 必须通过与血浆中 LBP 及细胞膜上 CD14 结合才能行使其生物学功 能3。LBP 和 CD14 两种蛋白是促使 LPS 与单核-巨噬细胞相互作用的细胞基础和分子基 础，血中的 LBP 能认识和结合 LPS，与之形成 LPS-LBP 复合物，并通过单核- 巨噬细胞膜 上的 CD14 受体激活这些细胞，产生各种细胞因子如 TNF、白细胞介素类、前列腺素及其 它可溶性细胞介质4，在早期肝脏损害中起关键作用5。 我们发现乙醇喂养大鼠血浆中内毒素水平明显高于对照组大鼠，其肝脏出现脂肪变性、 坏死及炎性细胞浸润等病理学改变，肝组织中 LBP 和 CD14 mRNA 表达明显增强，同时伴 有血清中 ALT 升高。LBP 和 CD14 基因的表达可能与乙醇喂养大鼠肝脏内的炎症反应和坏 死有关，这些变化与文献报道一致。Yin 等6发现乙醇能诱导大鼠表达 CD14 基因和 CD14 蛋白，而这些基因或蛋白的表达能增加大鼠肝脏对乙醇的敏感性和肝脏库普弗细胞释放 TNF、氧自由基、白介素及其它因子，最终导致肝细胞损害7 。因此，我们认为肝组织 中 LBP 和 CD14 基因及蛋白的增高可能是乙醇诱导肝细胞损害的重要机制之一。 已证实内毒素血症时血中 LBP 水平增高的机制是肝细胞产生急性期反应蛋白所致， 但 ALD 时肝组织中 CD14 mRNA 表达增高的机制尚不完全清楚。已证明 CD14 基因和 CD14 蛋白主要由单核-巨噬细胞表达和产生，酒精性肝病时肝内单核- 巨噬细胞来源有两类， 一类是肝内固有的巨噬细胞即库普弗细胞，第二类是炎症反应时血循环中浸润到肝脏的单 核细胞和巨噬细胞等，它们均能表达高水平的 CD14 基因和产生 CD14 蛋白。两类细胞均 可能增加对内毒素的敏感性，导致核转录因子 NF-B 的激活和前炎症性细胞因子的产生和 释放，最终诱导肝脏细胞损害 血液中细菌内毒素微量测定与临床意义 自 1968 年 Levin 和 Bang 发现并建立鲎试验方法以来，逐渐得到临床和药检部门的重 视。尤其是在临床检验方面的应用更是飞速发展。随着鲎试验方法研究和测定仪器的不断 完善，内毒素测定已由最初的定性凝胶法向灵敏度更高的微量定量方面发展。目前，在日 本，以合成基质法为中心的血浆内毒素测定变得更快速，准确，更加使用于临床各种感染 症状的诊断。 据国外文献报道：正常人血浆中的内毒素水平一般在 3pg/ml 左右，然而由于前处理 方法及测定原理的不同其值也存在着一定差异。随着血液前处理方法的标准化和国内血液 前处理液的生产，我国临床内毒素的定量动态检测水平将会提高，内毒素仪器的定量检测 的标准化进程将会加速。 研究表明：内毒素血症多随病情恶化而加重，随病情缓解而减轻。因此，内毒素可以 作为一个衡量病情和判断预后的一个参考指标，也可用于指导临床治疗、判断疗效和筛选 恰当的药物。 目前应用鲎试验阳性对内毒素血症进行诊断，以鲎试验浊度法或基质显色法测定，血 浆内毒素浓度大于 0.1EU/ml 为定量标准，并证实它对革兰氏阴性菌败血症的判断优于血培 养。应用该法探讨不同疾病的内毒素血症发病率，结果为急性肝炎 3764，爆发性肝 炎为 58100，且腹水与无腹水有显著差异。 胆石症拌或不拌感染均有不同程度的内毒素临床表现，在急性梗阻性化脓性感染时， 内毒素血症发生率最高（85） ，而阴性仅占 21，且内毒素病员低血压与死亡率是革兰 氏阳性菌血症的 2 倍。 Nachum 等应用尿液稀释凝胶法研究了 1286 例尿路感染病例发现：鲎试验区分显著性 和非显著性菌尿症的能力为 93。国内不断尿路感染时，尿液内毒素浓度大于 5ng/ml 为 84，而非感染者仅为 2.3%。 早期诊断是多器官功能衰竭预防与救治的关键。一些实验表明，血浆水平的阳性预测 值颇高，有些学者提出内毒素水平对多功能衰竭的监测有预警意义，动态观测其变化，有 助于早期诊断与预防。 除此以外，内毒素与急重症疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、心血管系统疾病、 口腔系统疾病、泌尿系统疾病等有着密切关系，定量动态检测内毒素有助于疾病的早期诊 断和治疗。 烧伤内毒素血症 烧伤可由热水、蒸气、火焰、电流、激光、放射线、酸、碱、磷等各种因子引起、烧 伤除了高温直接造成局部组织细胞损伤外，整个机体会产生一系列的改变。处于应激状态 可能释放出各种生物物质而引起烧伤的局部炎症和全身反应。 除此以外，应激还可以肠粘膜屏障功能及免疫功能受损，大量内毒素通过肠粘膜释放 入血，血中高浓度内毒素，又刺激单核巨噬细胞产生多种炎性介质，如肿瘤坏死因子、白 细胞介质-1 、白细胞介质-8 和白细胞介质-6 等，进一步加重机体的病理反应，使临床症状 更加严重。 动物试验及临床均表明，烧伤早期即出现内毒素血症。尽管现代医学技术和重症监护 水平的在不断提高，但是烧伤后多器官功能衰竭的死亡率仍居高不下，成为进一步提高烧 伤救治成功率的一大障碍，而内毒素是诱发多器官功能衰竭的重要因素。因此，早期控制 烧伤内毒素血症在减少并发症即死亡率反面是至关重要的。 动物实验模型显示，烧伤后门静脉血浆内毒素于伤后 3-6 小时即显著升高，7-12 小时 达高峰，24 小时后有所下降，但仍居较高水平。同时，烧伤后肝静脉血清肝功能指标 ALT、LDH 亦与 36 小时升高，12 小时达高峰，且数值大于正常值的 2 倍以上，伤后 24 小时下降，且仍显著高于对照组。以上结果提示早期肝脏损害与肠源性内毒素有非常密切 的关系，肠源性内毒素可能是导致烧伤早期肝损害的主要因素之一。Winchnrch 等人对一 组 39 例不同烧伤面积的病人，在伤后 5 天内连续进行血浆内毒素，结果表明，血循环中内 毒素的平均含量与烧伤面积相关；伤后 34 天有一峰值。他们又对另外 29 例烧伤面积 2075的病人，进行伤后两周内定期抽血检查，内毒素阳性者 17 例（占 58.6） 。结 果提示烧伤内毒素血症比较常见，而且内毒素血症与革兰氏阴性杆菌菌血症或创面脓毒症 的相关率为 71%。 在烧伤的合并症中，如休克、脓毒症、肝损害，尤其是革兰氏阴性杆菌败血症的发生、 发展中，如前所述，在某种程度上，内毒素起着“拨机”的作用，因此烧伤早期控制内毒素 血症有着十分重要的意义。这一点已经引起了临床医师的高度重视。 内毒素血症免疫低下儿童发烧的一个重要原因 免疫低下儿童出现原因不明的发烧是很普遍的事情，在诊断和治疗上一直曾在着许多 问题，能作出正常诊断的只占病例的 4060，因此，临床医生往往不得不根据经验应 用抗生素治疗，其疗效不甚理想。 Aad Hess 等人对 36 例免疫低下儿童进行了研究。在发烧期间，利用鲎试剂多次检验 了病人血中内毒素的浓度，其中 11 例的病人（35.5）的血中内毒素含量 0.1 EU/ml （内 毒素血症的诊断标准） ，其中一例检测数值位于 0.230.64 EU/ml 之间。25 例内毒素 0.1 EU/ml 的病人没有一例血培养阳性，没有一例死亡。在 11 例内毒素高的病人有 5 例 死亡（45.5%）,而活下来的人，随着血中内毒素含量的下降，逐渐好转至痊愈。 Aad 等人的研究表明，免疫机能低下儿童发烧时，如果找不到细菌感染迹象或菌血症 候，内毒素血症可能是引起发烧的原因之一。这与 Harris 等人对免疫低下成人的研究报告 相一致。在有些儿童中，尽管同时感染了革兰氏阳性细菌或霉菌，内毒素血症仍可能是造 成发烧的主要原因。 免疫低下儿童易发生内毒素血症的原因可能在于，各种原因造成的细菌或病毒感染， 尤其是革兰氏阴性菌感染并发的内毒素血症；另一原因可能是各种原因造成的肠粘膜功能 受损，使肠道内细菌、内毒素移位，大量内毒素进入血液造成内毒素血症。 鲎试验对检测内毒素具有特异性，利用鲎试验法可以确定不明原因的发热，仪器测定 法快速简捷，可以及时发现隐蔽的易被忽略的感染，具有显著的临床指导意义。 内毒素血症-发烧病人败血症的早期预测 革兰氏阴性菌败血症是住院病人死亡的重要原因。确切诊断要根据血培养结果，需花 费几天时间。实验证明，无论是人和动物，革兰氏阴性菌败血症所许多症状是由内毒素血 症造成的。内毒素可以激活单核巨什细胞系统，通过白血病介素1、白血病介素6、白 血病介素8、肿瘤坏死因子等产生一系列毒性反应。内毒素是革兰氏阴性菌败血症的主要 致病因素。用鲎实验法测定病人血中内毒素，可以预测发烧病人败血症发生率。 Sander 等人对 473 例发烧病人血中内毒素进行了研究，其中发生败血症病人在 3 天追 踪观察期间有 6 人（32）死亡，而 454 个无败血症病人只死亡 26（6） 。研究表明，血 中内毒素浓度测定是预测败血症的极佳指标，此方法快速、简便，对指导临床用药具有重 要意义。 过去的临床工作中，找不到一个可靠的指标准确地预测病人将要发生败血症。Sander 等人的研究表明，鲎试验法检测结果预测败血症的敏感性为 79，特异性为 96。从全体 发烧病人有 4会发展为败血症来计算，鲎试验的阳性预测值为 48，阴性预测值为 99。凡是内毒素试验结果为阴性的病人基本上排除 3 日内发生败血症的可能，而内毒素 阳性的发烧病人则有发生败血症的高度危险性。 过去认为，菌血症就等于败血症，而败血症血培养的预测值仅为 15，因此用鲎试验 检测内毒素的方法对发烧病人是否发展成败血症的预测是一个非常有用的方法。 内毒素与胆道感染 胆道感染致病菌绝大多数为肠源性革兰氏阴性菌。重症急性胆管炎时胆道压力增高， 造成毛细胆管破裂、坏死，胆汁中革兰氏阴性菌裂解释放出的内毒素可经肝细胞屏障直接 进入肝血流而导致内毒素血症。此外，由于血管从位于小胆管粘膜层下的解剖特点可造成 胆汁中内毒素经胆小管枣静脉返