内毒素耐受和胆碱能受体兴奋对巨噬细胞贮存和分泌tnfα的影响

内毒素耐受和胆碱能受体兴奋对巨噬细胞贮存和分泌 TNF 的影响 解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所 吕 艺 周国勇 胡 森 【摘要】 目的 探讨内毒素耐受和拟胆碱药物卡巴胆碱对巨噬细胞 TNF 分泌的调节作用。方法 分离小鼠腹腔巨噬细胞，将其与 LPS 作用不同时间； 小鼠腹腔巨噬细胞分为三组：空白对照组 （RPMI1640 常规培养） ，LPS 耐受 +刺激组（LPS 预刺激 20h,再用 LPS 刺激 4h）和 LPS 刺激组 （RPMI1640 常规培养 20h 后，再加 LPS 刺激 4h） ；分离大鼠腹腔巨噬细胞，分为三组：空白对照组、 LPS 刺激组及卡巴胆碱预处理后 LPS 刺激组。收集各组细胞培养上清液及细胞裂解液，用 ELISA 方法检 测 TNF 浓度。结果 LPS 预刺激巨噬细胞 20h 后再次用 LPS 刺激时，其 TNF 分泌量不增加，与对照组 接近，同时细胞内 TNF 含量也不增加。未经 LPS 预刺激的巨噬细胞在受到 LPS 刺激后 TNF 分泌量大 幅增加，同时细胞内 TNF 含量也伴随增加，即细胞分泌和贮存的 TNF 量变化一致。卡巴胆碱预处理巨 噬细胞受内毒素刺激后 TNF 分泌量低于单纯内毒素刺激组细胞，但细胞内的 TNF 含量高于对照组，与 单纯内毒素刺激组接近。 结论 巨噬细胞建立内毒素耐受机制或受到拟胆碱药物作用后，再次受到 LPS 刺激后均表现为 TNF 分泌的减少，但细胞内 TNF 量变化规律不一致。提示内毒素耐受和胆碱能抗炎所 致巨噬细胞炎症反应特性改变的机制不同。 【关键词】巨噬细胞；内毒素耐受； 拟胆碱药；肿瘤坏死因子 【Abstract】Objective To investigate the difference of regulating TNFsecretion between endotoxin tolerance and cholinergic drug-carbachol pre-treated macrophages. Methods the peritoneal macrophages were obtained from male mice, which were exposure to endotoxin(LPS) for 0, 2, 4, and 8 hours; the isolated peritoneal macrophages were divided into 3 groups: control(RPMI1640 routine culture), LPS pre-treatment(pre- exposure to LPS followed by LPS stimulation, and LPS stimulation; the peritoneal macrophages of rats were isolated and were divided into 3 groups: Control, LPS stimulation, and carbachol pre-treatment (LPS stimulation following pre-exposure to carbachol) groups. Lysate of macrophages in experiment and cell supernatants in all experiments were harvested to determined the content of TNF by ELISA method. Results The amount of TNF secretion in LPS pre-treated macrophages was not increased following stimulated with LPS again, and no difference was observed between LPS pre-treated and control groups. No increase in TNF content was observed in LPS pre-treated macrophages. But for the LPS untreated macrophages, the amount of secreted TNF was increased dramatically and accompanied with the increase of TNFcontent in the macrophages after being stimulated by LPS, namely both secreted and reserved TNF were significant high. For carbachol pre-treated cells, the amount of their secreting TNF was lower in than that of carbachol untreated cells, but the content of TNF in cells was higher than that in the control, and it was close to that in the LPS stimulating cells. Conclusion After being stimulated by LPS, both endotoxin tolerant and cholinergic pre-treated macrophages reduced to secrete TNF, but the variation of TNF content in the two groups was out of accord. It is suggested that in macrophages, the mechanisms of inflammatory change induced by endotoxin tolerance and cholinergic antiinflammation are different. 【Key words】 macrophage; endotoxin tolerance; cholinergic; tumor necrosis factor - 尽管对于感染性疾病的治疗手段已经有了长足的进步，然而，脓毒症仍然是世界范围 内主要的死亡原因之一 1，2 。来源于革兰氏阴性细菌的内毒素（lipopolysaccharide, LPS）是脓毒症的主要启动因素 3。在脓毒症的发生、发展过程中，内毒素作用主要有两方 面：一是诱导失控的炎症反应 4，大量分泌的炎症介质导致免疫亢进、组织细胞坏死及脏 器功能衰竭；另一个重要机制是内毒素能够诱导单核巨噬细胞对内毒素本身的不反应状态， 又称为“内毒素失敏”或“内毒素耐受” 5。动物实验观察到，给与低剂量内毒素预处理， 可明显降低随后给与致死性内毒素打击的动物死亡率 6，这是内毒素耐受机制建立后，对 机体有利的一面；另一方面。内毒素耐受可以导致“免疫抑制” 7，这也是部分脓毒症晚 期病人重要的死亡原因之一。因此，研究内毒素耐受机制将有助于我们寻找防治脓毒症的 新策略。 胆碱能抗炎通路的提出，为脓毒症及其它以失控炎症反应为特征的疾病提供了一种新 的防治理念。细胞和动物实验均显示，胆碱能药物能够有效地抑制炎症性细胞因子的表达 和释放 8，9 ，具有与巨噬细胞内毒素耐受相似的效应。 在本研究中，我们比较了内毒素耐受和拟胆碱药卡巴胆碱预处理巨噬细胞的肿瘤坏死因子- （tumor necrosis factor ，TNF）分泌量和细胞内含量的异同，旨在为防治脓毒 症和失控炎症反应相关疾病提供更合理、有效的策略。 1 材料与方法 1.1 动物及巨噬细胞的获取 清洁级雄性 Wistar 大鼠，180-220g；清洁剂 6 雄性昆明小鼠， 18-22g。动物均购自协和医科大学实验动物中心。动物在本实验室适应一周，纳入实验。 饲养条件：22-25，12h 光照/12h 黑暗。实验前 12h 禁食，自由饮水。脱臼法处死动物 后，浸入 70%乙醇中消毒。固定四肢，剪开腹部皮肤，钝性分离至暴露出腹膜壁。碘伏和 75%酒精消毒腹膜壁，注射器吸 RPMI1640 从腹白线处注入腹腔中（大鼠 20ml。小鼠 5mlX2 次） ，轻揉腹壁后，吸出灌洗液，注入无菌离心管中。 4，250g 离心 10 分钟后，弃上清， 加 RPMI1640 培养液（含 10%胎牛血清、100U/ml 青霉素、100g/ml 链霉素） ，将细胞打散。 计数细胞，将细胞调整至 106细胞/ml。胎盼蓝染色观察细胞活力在 95%以上。将细胞悬液 加入 24 孔培养板中，1m/每孔，置 37、5% CO2 细胞培养箱中孵育 2 小时。除去培养液， PBS 洗细胞 2 次，RPMI1640 洗 1 次，去除非贴壁细胞。再加新 RPMI1640（含 10%FCS） 。根 据不同实验要求做相应处理。 1.2 实验分组及处理 1.2.1 卡巴胆碱对 LPS 刺激巨噬细胞分泌 TNF 的影响 上述所取大鼠腹腔巨噬细胞，调整 浓度为 106细胞/ml。在 24 孔培养板中，每份细胞加入 3 孔，每孔加入 1ml；3 孔细胞分别 进入 3 组：对照组、LPS 刺激组、卡巴胆碱+LPS 刺激组。加入卡巴胆碱终浓度为 20mol/L，在加入 LPS 前 15min 加入；加入 LPS 终浓度为 100ng/ml。 1.2.2 LPS 耐受对巨噬细胞分泌 TNF 的影响 上述所取小鼠腹腔巨噬细胞分为三组：空 白对照组（RPMI1640 常规培养） ，LPS 耐受+刺激组（LPS 预刺激 20h,再用 LPS 刺激 4h）和 LPS 刺激组（RPMI1640 常规培养 20h 后，再加 LPS 刺激 4h） 。LPS 作用的终浓度为 100ng/ml。 1.2.3 LPS 作用不同时间的腹腔巨噬细胞分泌 TNF 的规律 在 24 孔板中，每份细胞加入 4 孔；在相应时间点，每孔加入 LPS（终浓度为 100ng/ml） ，分别作用 0h，2h，4h，8h，收 集培养上清，测定 TNF 浓度。 1.2.4 细胞裂解液的制备 各组细胞培养终点，吸取培养上清液后，用 PBS 洗细胞 3 次；加 入非变性蛋白裂解液 0.5ml/孔，反复吹打，置冰浴中 20min，转至样本管中，-20冻存。 1.3 TNF 浓度的检测 采用 ELISA 方法测定细胞培养上清液和细胞裂解液中 TNF 水平。 1.4 统计学分析 实验数据以均数 标准差表示，用 SPSS12.0 对数据进行成对资料的 t- 检验。P0.05 为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 LPS 刺激时间对巨噬细胞分泌 TNF 的影响 图 1 结果显示，用 100ng/ml 的 LPS 刺 激巨噬细胞不同时间， TNF 的分泌量增加；以刺激后 4h 时间点增加幅度最大，8h 点有 所回落。 TNF (pg /ml ) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0h 2h 4h 8h 图 1 LPS 刺激巨噬细胞不同时间 TNF 分泌量的变化（n=6） 2.2 LPS 耐受对巨噬细胞 TNF 分泌量和细胞内含量的影响 体外正常条件下培养的巨噬 细胞仅分泌少量 TNF；给予 LPS 刺激 20h，培养上清液中 TNF 含量大幅增加。然而，当 以 LPS 再次刺激 LPS 预处理 20h 的巨噬细胞（LPS 耐受细胞）时，可以发现其 TNF 含量 远远低于未经 LPS 预处理的巨噬细胞（图 2） ，这部分细胞即为 LPS 不耐受巨噬细胞。同时 看到，细胞裂解液中 TNF 含量与细胞培养上清液中 TNF 的含量变化规律一致。进一步 分析数据可以发现，LPS 不耐受细胞裂解液中 TNF 增加的比例远高于培养上清液增加的 比例，而 LPS 耐受的细胞在受到同样剂量的 LPS 刺激同样的时间后，却不出现细胞内 TNF 的增加（图 3） 。 TNF （p g/m l) 0 20 40 60 80 100 120 对 照 LPS耐 受 LPS不 耐 受 *# TNF （p g/m l) 0 100 200 300 400 500 600 对 照 LPS耐 受 LPS不 耐 受 *# 图 2 LPS 刺激对巨噬细胞 TNF 分泌的影响(n=6) 图 3 LPS 刺激对巨噬细胞中 TNF 含量的影响(n=6) *p0.05(与 LPS 耐受组比较), #p0.01(与对照组比较) *p0.05(与 LPS 耐受组比较) #p0.05(与对照组比较) 2.2 卡巴胆碱对巨噬细胞 TNF 分泌量和细胞内 TNF 含量的影响 图 4 结果显示，给予 卡巴胆碱预处理的巨噬细胞，当受到 LPS 的刺激时，尽管其培养上清中 TNF 含量也增多， 但增加的幅度显著低于未经卡巴胆碱预处理的细胞培养上清（p0.01） （图 4） 。同时测定 细胞裂解液的 TNF 可以发现，卡巴胆碱预处理细胞的 TNF 含量与 LPS 不耐受的细胞同 样表现为较大幅度的增加（p0.05） （图 5） 。 TNF (pg /ml ) 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 对 照 组 Car+LPS组 LPS刺 激 组 * *# 0 50 100 150 200 250 300 350 对 照 LPS+卡 巴 胆 碱 LPS刺 激 TNF 浓度 （p g/m l) * * 图 4 大鼠巨噬细胞培养上清中 TNF 浓度(n=4) 图 5 大鼠巨噬细胞裂解液中 TNF 含量(n=4) *p0.05(与对照组比较), #p0.01(与 Car+LPS 组比较) *p0.01(与对照组比较) 3 讨论 TNF是机体炎症反应过程中释放最早、最重要的促炎细胞因子之一。也是巨噬 细胞受到LPS刺激后释放增加最显著、在对LPS 耐受后分泌受到抑制最明显的炎性细胞因 子。因此，在LPS 耐受研究中，TNF分泌量的变化作为评价LPS 耐受的指标具有良好的 代表性 10 。本研究中看到，对 LPS 不耐受的巨噬细胞在受到LPS刺激后2h就出现TNF 释放的明显增多，在刺激4h时增加的幅度更大；而对LPS建立耐受机制的巨噬细胞，在受 到LPS的再次刺激时，其 TNF分泌量与对照组接近，呈现一种不反应即耐受状态，与未 建立LPS耐受的巨噬细胞大量分泌TNF形成鲜明的对比。表明经LPS 作用20h 的巨噬细胞 已经建立LPS耐受机制。 针对脓毒症时炎症细胞激活后大量致炎细胞因子分泌的损伤效应，研究人员已尝试将 多种药物用于抗炎，抑制这些炎症因子的表达和释放，胆碱能抗炎通路就是近年来的关注 热点之一 11。动物实验和体外细胞培养均已证实，胆碱能药物具有确定的抑制炎症细胞因 子释放的作用 8，12 ，在动物实验中还观察到，拟胆碱药物在转录水平对致炎细胞因子也具 有调节作用 13。本研究中我们看到，用卡巴胆碱预处理后再经 LPS 刺激的巨噬细胞分泌 TNF 的量显著低于单纯用 LPS 刺激的巨噬细胞。显示卡巴胆碱具有抑制致炎细胞因子分 泌的作用，并且这一效应与 LPS 耐受的巨噬细胞反应类似。 我们进一步分析细胞内 TNF 含量的变化时发现，内毒素耐受细胞与卡巴胆碱预处理 细胞对 LPS 刺激反应存在差异：内毒素耐受巨噬细胞受到 LPS 刺激时，其细胞内 TNF 含 量与其分泌到细胞外的 TNF 含量呈一致性变化，即均表现为减少；而卡巴胆碱预处理的 巨噬细胞，虽然在受到 LPS 刺激后其 TNF 分泌量减少，但其细胞内 TNF 含量与单纯用 LPS 刺激的巨噬细胞呈一致性增加，即细胞分泌量减少，而细胞内含量并不减少。提示内 毒素耐受巨噬细胞 TNF 分泌的减少与其合成/表达减少有关；卡巴胆碱预处理的巨噬细胞 TNF 分泌减少并非由于其合成/表达减少所致，而是与其分泌减少有关。由此设想，在防 治失控炎症反应疾病时，可以从调节细胞的分泌机制着手，改善炎症细胞因子释放增加对 机体造成的影响。 巨噬细胞在建立内毒素耐受的过程中，其致炎细胞因子和抗炎性细胞因子的分泌有其 自身的规律：致炎因子 TNF 分泌量的变化呈现一种先增加、继而减少的趋势；而抗炎性 细胞因子 IL-10 分泌量在前期稳定，而后增加。这种变化规律与脓毒症早期出现的失控炎 症反应和晚期表现为免疫抑制基本一致。因此，内毒素耐受而产生的致炎因子释放减少虽 然有利于减轻炎症性损伤，但继而又可能出现的 IL-10 释放增加成为脓毒症晚期病人预后 不良的潜在威胁 14。拟胆碱药物对体外细胞培养巨噬细胞 TNF 和 IL-10 释放的影响与内 毒素耐受有类似之处，受拟胆碱药物作用的巨噬细胞在 LPS 刺激早期表现为 TNF 释放受 抑制，IL-10 的分泌不受影响 8。动物实验中可以看到外周血白细胞 TNF 表达下调的伴 随 IL-10mNA 表达的上调。提示拟胆碱药物在抗炎的同时，具有免疫调节作用 13。 综上所述，深入研究拟胆碱药物的抗炎及免疫调节机制，并与巨噬细胞内毒素耐受机 制进行比较性研究，可以拓展防治脓毒症及失控炎症反应相关性疾病的研究思路，从而构 建更加有效、合理的防治理念。 参考文献 1. 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