分子生物学大实验资料

名解： 1. PCR：聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的技术。 2. T 载体：是一种高效克隆 PCR 产物的专用载体。 3. 感受态细胞：处于容易吸收外源 DNA 状态的细胞。 4. 转化：指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 5. 质粒：一类在细菌细胞内发现的一种自我复制的非染色体小型环状双链 DNA 分子。 6. 共价闭环 DNA（cccDNA）：通过共价键形成的封闭环状 DNA 分子，常以超螺旋的形式存在。 7. 开环 DNA（ocDNA）：如果 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力， 这种松弛型的分子就叫开环 DNA。 8. 限制性核酸内切酶：能在特异位点上催化双链 DNA 分子的断裂，产生相应的限制性片段。 9. 基因组：单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。 10. 菌落 PCR： 可不必提取基因组 DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增。 11. 连接酶：又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。 12. 回文结构：双链 DNA 中含有的两个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称为回文结构，每条 单链以任一方向阅读时都与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的。 一、CTAB 法提取植物基因组 DNA 各试剂的作用： 1、提取液去除植物组织中的部分多糖、多酚类化合物等杂质，释放 DNA。 2、CTAB 为去污剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，破坏细胞膜，同时可使核蛋白解聚，从而使得 DNA 得 以游离出来。 3、-巯基乙醇可以抑制酚类化合物的氧化。 4、可溶性聚乙烯吡咯烷酮去除多酚类化合物等杂质。 5、EDTA 是一种螯合剂，能抑制 DNase 的活性. 6、苯酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制 DNA 酶活性；并有利于水相和有机相的分离 7、酚/氯仿/异戊醇，Tris 饱和酚：作为氧化剂，去蛋白。 8、加入 Tris 饱和酚离心后可分为两相，上层为含核酸的水相，下层为有机相，分界处为变性凝聚的蛋白 质。 9、70%乙醇：去除溶于水的盐及杂质。 10、RNase 去除 RNA 污染。 二、提取 DNA 的实验结果 1、DNA 提取失败，未见大片段 DNA. 2、基因组 DNA 片段完整。 3、基因组 DNA 片段完整，但有 RNA 污染。 4、基因组 DNA 片段有降解，有蛋白质、RNA 污染。 三、PCR 的体系与反应原理 1、体系 1、10*buffer：保证反应体系的弱碱性和最适 PH 值，使 TaqDNA 聚合酶 正常发挥作用。 2、DNA 模板（template） ，含有需要扩增的 DNA 片断。 3、2 个引物（primer） ，决定了需要扩增的起始和终止位置。 4、DNA 聚合酶（polymerase） ，复制需要扩增的区域。 5、脱氧单核苷酸（dNTP） ，用于构造新的互补链。 6、Mgcl 2：促使酶的活性，影响 PCR 产量和产物的特异性。 7、缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。 2、基本原理及过程 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 其过程可简述为：在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板 DNA，四种 dNTP，和耐热的 Taq 聚合酶及 两个合成的 DNA 引物，并有镁离子存在。 变性-退火- 延伸三温度点 1、变性：加热使模板 DNA 在高温下（94-95 ）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。若低于 93则需 延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性， 就会导致 PCR 失败。 2、退火：在体系温度降至 37-65，模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链 3端结合， 形成部分双链 DNA。 3、延伸：体系反应温度升至中温 72，耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混 合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP） ，按 5到 3方向复制出互补 DNA，过高的延伸温度不利于引物和模板的 结合。 3、PCR 电泳图：与 marker 扩增出来在同一位置，eg500bp；若不同，则为非特异性扩增。 4、PCR 反应中，两条引物上的互补碱基相结合形成的聚合体，为引物二聚体。 四、PCR 产物的 T 载体连接 1、为什么要用 T-载体？ 答：高效克隆 PCR 产物的专用载体，可以大大提高 PCR 产物的连接，克隆的效率。 2、蓝白斑筛选的原理： 答：现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的 DNA 的短区段，其中有 -半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列 和前 146 个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS ） ，它并不破坏读框，但可使少 数几个氨基酸插入到 -半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码 -半乳糖苷酶 C 端部分序列 的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白 质。这样，lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称 为 -互补。由 -互补而产生的 LacZ+细菌在诱导剂 IPTG 的作用下，在生色底物 X-Gal 存在时产生蓝色菌落， 因而易于识别。然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无 -互补能力的氨基端 片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。 3、PMP18-T 载体结构三个箭头的意思： ori：复制起始位点 选择性基因（多克隆位点）：P 启动子区；O 操纵子去；lacZ:乳糖操纵子 抗性基因：Ampr- 抗氨苄基因 4、用到的两个试剂：ECOR1 、Sal 1 5、切割位点：EcoR1 （GAATTC） ；Sal 1 （GTCGAC） 6、连接所用的酶：T4DNA 连接酶 五、感受态细胞的制备原理及方法： 1、原理： 细菌处于 0， CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA 形成 DNA 酶的羟基- 钙磷酸复合 物粘附于细胞表面，经 42短时间热击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。将细菌置于在非选择性的培养基中 保温一段时间，促使转化过程中获得新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含氨苄青霉素的选择培养基 上。转化体在氨苄青霉素的选择培养基上能够存活，而未手转化的受体细胞因无抵抗氨苄青霉素的能力而不能 存活，因此就不能在选择培养基上形成菌落。 2、方法： 步骤： 1. 取甘油保存的 DH5 在 LB 固体培养基上划线，37培养过夜。 2. 然后挑单菌落于另一 LB 培养基上划线， 37培养过夜。 3. 从 LB 平板上挑取一个单菌落，接到 3mllb 培养基中，37震荡培养过夜。 4. 取 0.5ml 培养过夜的菌液，转入 50mlLB 培养基中，37震荡培养 1.5h-2h。使菌液 OD 达到 0.3-0.4.（细胞数 务必小于 10ml，此为成功 的关键） 5. 将菌液在冰上放置 5-10min 后，4下 2500rpm，离心 5min 集菌。 6. 弃上清，加入 10ml 0.1mol/L 的 CaCl2，冰上悬浮沉淀，至少 20min。 7. 4下 2500rpm，离心 5min 集菌，加入 2ml 冰冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 悬浮菌体 8. 分装细胞，每 200ul 一份。此细胞即为感受态细胞，冰上放置 4h 后备用。 转化： 1. 取 200ul 新鲜制备的感受态细胞，加入连接产物（ 10ul）混匀，同时做两个对照管。 阴性对照：200ul 感受态细胞 +2ul 无菌水 阳性对照：200ul 感受态细胞 +2ul（50ng）标准质粒;冰上放置 30min 2.42 循环水浴锅中，放置 90sec，迅速置于冰上 2min。 3.每管加 800ulLB 液体培养基，37震荡培养 60min。3000rpm 离心 5min，弃上清 800ul。混匀残液，全部吸取 涂布在含有 X-Gal（20ul）,IPTG （20ul ）, AMP 的 L-琼脂平板培养基上。37培养，正面放置 10min 后倒置培 养过夜，形成单菌落。计数白色，蓝色菌落。 4.挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。 3、X-Gal 作用: 水解后呈蓝色。基于这个特点， pUC 系列载体 DNA(或其他带有 lacZ 基因载体 DNA)以 lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用 M13 噬菌体载体 DNA 进行转染时，如果在平板培养基中加入 XGal 和 IPTG，由于 半乳糖苷酶的 互补性，可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。 IPTG 作用 : 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂 ,不被细菌代谢而十分稳定，可诱导 X-Gal 发生变化。 AMP 作用： 筛选出有 Amp 抗性基因的菌株，是个分子标记，可以将某个基因用 Amp 抗性基因标记，如果能 长在含有 Amp 的培养基上，说明这株菌中包含了目的基因和 Amp 抗性基因。 六、质粒的提取、纯化 1、质粒提取方法为碱性 SDS 方法。 2、提取原理：基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。具体看讲义 3、质粒提取、纯化的试剂及作用 溶液 I：Tris.cl 、EDTA 使细胞重悬、分解 RNA 溶液 II：SDS 和 NaOH 碱性溶液，使菌体裂解，使菌体的蛋白质变性从而释放出质粒 DNA，遇到强碱而变 性。 溶液 III：Kac 酸性溶液，中和碱性溶液，使溶液处于中性，使质粒 DNA 复性。 酚/氯仿 /异戊醇：去除杂蛋白，并有助于液相与有机相的分开。 4、质粒提取的步骤 （1）在两只 50 ml 离心管中分别加入 10ml 含有 60ug/ul 氨苄的 LB 培养液，从两块转化平板上分别挑取单菌落 接种于其中，37 震荡培养过夜。 （2） 在 1.5ml 离心管中加入菌液 1.5-3ml,12000rpm 离心 2min,收集细菌沉淀，倒掉上清。 （3）将细菌沉淀中加入预冷的溶液 1200ul，剧烈震荡将菌液充分混匀。 （4） 加入溶液 II200ul，盖严管盖颠倒微型离心管 5 次以混合内容物，不要剧烈震荡，至溶液变得澄清，冰浴 放置 5min 。 （5） 溶液澄清后加入预冷的溶液 III200ul，温和震荡 10S，冰上放置 3-5min。 （6） 12000g，4离心 5min,取上清移至一个新的 Eppendorf 管中。 （7） 加入 等体积的酚 /氯仿/ 异戊醇（25:24:1） ，震荡混匀，去除杂蛋白，12000g，4下离心 5min,取上清移至 另一个 Eppendorf 管中。 （8） 加入 2 倍的体积无水乙醇，震荡混匀，-20 放置 20min （9） 12000g, 离心 5min，弃上清 （10）70%乙醇洗脱，直接倒去 70%乙醇，再离心 30s，将管壁上的乙醇沉淀，用枪头吸去多余的乙醇。将管放 置在滤纸上，室温下蒸发痕量的乙醇 10-15min。 （11）最后加入 50ul 的 TE 溶液溶解，37 水浴，30min,降解 RNA。 （12）电泳检测实验结果 5、质粒电泳图顺序： 点样孔、开环质粒 DNA、线性质粒 DNA、双螺旋质粒 DNA,RNA 污染 注：用于转化的质粒 DNA 应主要是共价闭环 DNA。 七、限制性内切酶的酶切反应 1、种类 型限制性内切酶：限制、修饰 特点：需 Mg2+、ATP 和 S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性） 应用：不常用。 型限制性内切酶：识别并特异切割 DNA 分子, 即通常所指的 DNA 限制性核酸内切酶。 特点：仅需 Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链 DNA 的特殊序列，并可特异切割 DNA，产生特异性 的片段。 应用：种类繁多,分子克隆最常用的内切酶。 型限制性内切酶：限制、修饰 特点：需 Mg