单克隆抗体研制最详细步骤

单克隆抗体研制最详细步骤 作者： 时间：2008-05-15 15:54:24 来源: 生物谷 浏览评论 1、单抗的标记 目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断（盒）的 形式提供，其中核心为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。 （1） 酶标记 A、 辣根过氧化物酶（HRP）标记 辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多的常用方法是过碘酸钠法。其原理是 HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛 基，加入 IgG 后该醛基与 IgG 氨基结合，形成 Schiff 氏碱。为了防止 HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发 生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定 Schiff 氏碱。这 里介绍两种程序。 程序一： a. 将 5mg HRP 溶于 0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中；加 0.5ml 10mmol/L NaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞， 室温避光作用 2 小时。 b. 加 0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。 c. 加入 0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。 d. 称取 Sephadex G25 干粉 0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的 5ml 注射器外筒内；随后将上述交联物移入注 射器外套；盖紧，室温作用（避光）3 小时或 4过夜。 e. 用少许 PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V 体积新鲜配制的 5mg/ml NaBH4 溶液，混匀，室 温作用 30 分钟；再加入 3/20V NaBH4 溶液，混匀，室温作用 1 小时（或 4过夜）。 f. 将交联物过 Sephadex G200 或 Sepharose 6B（2.650cm）层析纯化，分管收集第一峰。 g. 酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量（mg/ml）=OD4030.4 IgG 量（mg/ml）=（OD280-OD4030.3）0.62 克分子比值（E/P）=酶量4/IgG 量，一般在 1-2 之间。酶结合率=酶量体积/，标记率一般为 0.3-0.6， 即 1-2 个 HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于 0.6，0.8，0.9；OD403/OD280 等于 0.4 时，E/P 约 为 1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定 可应用 ELISA 法、免疫扩散、DAB-H2O2 显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活 性及效价、特异性。 h. HRP 抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20存放，防止反复冻融；或加入等量 60%甘油 4 保存；不宜加 NaN3 或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以 BSA 或脱脂牛奶作保护剂。 程序二： 1. 将 5mg HRP 溶于 0.3mol/L PH8.1 NaHCO3 溶液中，加入 1%二硝基氟苯无水乙醇溶液 0.1ml，室温搅拌作 用 1 小时，以封闭 HRP 分子上的 和 氨基。 2. 再加 1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅 30 分钟，溶液呈黄绿色；随后加 1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅 1 小时，中止氧化反应。 3. 移入透析袋中，在 1000ml 0.01mol/L PH9.5 碳酸盐缓冲液中，4透析过夜，更换三次缓冲液，注意避 光。 4. 吸取上述醛化好的 HRP 溶液 3ml，加入 5mg IgG 的碳酸盐缓冲液 1ml，室温轻搅 2-3 小时，避光；加入 5mg NaBH4 ，4放置 3 小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用 7 小时。 5. 再移入透析袋中，在 0.02mol/L PH7.4 PBS 中透析 24 小时，更换三次缓冲液。 6. 用 3000r/min 离心 30 分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许 PBS 溶解，透 析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。 7.8. 步骤同程序一。 B、 碱性磷酸酶（AP）标记 碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋 白的 NH2 分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率 低。其程序如下： 1. 将 5mg AP 加入 1ml 抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于 4对 0.01mol/L PH7.2 PBS 透析 18 小 时，换液三次。 2. 加入 2.5%戊二醛 20ul，室温作用 1-2 小时，4对 PBS 透析过夜，其间换液三次。 3. 换用 0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl 缓冲液透析，4过夜，换液三次。 4. 取出标记抗体，用含 1%BSA 的 Tris-HCl 缓冲液稀释至 4ml，即为 AP 标记物原液。 5. 每毫升中加入 0.4ml 甘油，小量分装，保存备用。 C、 PAP、APAAP 的制备 PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术）、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术）的制备 对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔 PAP、APAAP 供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为 PAP 法和 APAAP 法不用任何化学 交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP 和 APAAP 的制备方 法常采用先将 HRP 或 AP 加入抗 HRP 或 AP 的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有 助于免疫沉淀物的解离反应，调 PH 至 2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯 化 PAP 或 APAAP。 根据需要还可将 PAP 和 APAAP 先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断，这样，单抗即可一步 法用于诊断或检测试验等。 （2） 荧光素标记 A、 异硫氰酸荧光素（FITC）标记 FITC 标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与 IgG 的自由氨基结合，形成 IgG 与荧光素的结 合物。FITC 是最常用的荧光素，其次选用 TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC 和 TRITC 是常用的双标记 组合。其标记步骤如下： a. 以碳酸盐缓冲液（PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸馏水 1000ml）调整抗体浓度至 10mg/ml。 b. 取 5ml 抗体溶液置于 10ml 小烧杯中。 c. 称取 1mg FITC 溶于 0.2ml DMSO 中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅；其后室温避光作 用 2 小时。 d. 将交联物经 Sephadex G25 或 G50 柱层析除去游离的荧光素；分管收集第一峰为标记的抗体。 e. FITC 的结合物质量鉴定 IgG 量（mg/ml）=（OD280-OD4950.35）/1.4 F/P=2.87OD495/（OD280-OD4950.35），一般说，FITC 对抗体的摩尔比为 3：1 时适合于组织切片染色， 为 5-6：1 时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。 f. 标记抗体的保存：宜保存于 4，加 NaN3 防腐。 B、 异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记: 基本与 FITC 标记相同。 （3） 同位素标记 必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应包括避 免物理的接触和对 -射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置 含放射性的废料。 A、碘标记 用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I 衰变产生低能的 和 射线，很容易被检测出来，而其 60 天 的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。最常用的碘标记方法是氯胺 T 法，即将氧化 剂氯胺 T 加入到抗体和碘化物的溶液中，Na125I 在氯胺 T 作用下 I 转化成 I2，游离 I2 可与抗体分子中酪氨 酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及 还原剂分离开。其主要操作步骤如下： a. 在进行标记之前，先选用截流分子量为 20000-50000 的凝胶，制备 1ml 凝胶柱，然后分别用 10 倍体积的 1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和 PBS 洗涤柱体，封住柱下口，备用。 b. 加入 10ug 纯化单抗至含有 25ul 2.5mol/L 磷酸钠（PH7.5）的 1.5ml 指形管内。随后，加入 500uCi Na125I 混匀。 c. 加入 25ul 新配制的 2mg/ml 氯胺 T。室温放置 60 秒。再加入 50ul 氯胺 T 终止液（含 2.4mg/ml 偏重亚硫 酸钠，10mg/ml 酪氨酸，10%甘油和 0.1%环乙烷酰二甲苯的 PBS）。 d. 将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用 1.5ml 指形管收集。当碘标记物全部进入柱 体，加入 0.3ml 含 0.03%叠氮钠的 PBS，用另一指形管收集 0.3ml，然后再加 0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口 收集 0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体大约在第二至第四管出现。 无害化处理柱子和非单抗标记部分。 e. 将标记单抗保存于 4可使用 6 周时间。 B、 生物合成法标记 将杂交瘤在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位素会标记在抗体分子的初级氨基 酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。其主要步骤是： a. 离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需 2106 个细胞。以预热 37不含甲硫氨酸的培养基洗涤上 述细胞。 b. 用含 2% PBS 不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至 106 个/ml，加入 35S 甲硫氨酸（每次加入 100uCi 可产生 105-106cpm 的抗体）。 c. 经 C02 培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入 1/20 体积的 1mol/L Tris（PH8.0）及叠氮 钠至浓度 0.02%。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。 （4） 生物素标记 生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标 记。其主要步骤是： a. 用二甲基亚砜配制 10mg/ml 的 N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥 珀酰酯）。 b. 用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，PH8.0）稀释单抗溶液至 1-3mg/ml。 c. 每毫克抗体加入 25-250ug 的生物素酯，混匀后，室温作用 4 小时。 e. 按每 250ug 生物素酯加入 20ul 1mol/L NH4Cl 终止反应，室温放置 10 分钟。 f. 以 PBS 充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。 （5） 他标记技术 适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗，如金标记、化学发光标记、SPA 标记、铁蛋白标记等。 单克隆抗体的标记 发布时间： 2009-02-02 新闻来源： 目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形 式提供，其中核心试剂为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。 一、酶标记 1、辣根过氧化物酶（HRP）标记 辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是 HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成 醛基，加入抗体 IgG 后该醛基与 IgG 氨基结合，形成 Schiff 氏碱。为了防止 HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发 生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定 Schiff 氏碱。这里介绍 两种程序。 程序一： （1）将 5mg HRP 溶于 0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中；加 0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避 光作用 2 小时。 （2）加 0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 （3）加入 0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。 （4）称取 Sephadex G25 干粉 0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的 5ml 注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外 套；盖紧，室温作用（避光）3 小时或 4过夜。 （5）用少许 PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V 体积新鲜配制的 5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用 30 分钟；再加入 3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用 1 小时（或 4过夜）。 （6）将交联物过 Sephadex G200 或 Sepharose 6B（2.650cm）层析纯化，分管收集第一峰。 （7）酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量（mg/ml）=OD4030.4 IgG 量（mg/ml）=（OD280-OD4030.3）0.62 克分子比值（E/P）=酶量4/IgG 量，一般在 1-2 之间。酶结合率=酶量体积/抗体，标记率一般为 0.3-0.6，即 1-2 个 HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于 0.6，0.8，0.9；OD403/OD280 等于 0.4 时，E/P 约为 1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用 ELISA 法、免疫扩散、DAB-H2O2 显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、 特异性。 （8）HRP 抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20存放，防止反复冻融；或加入等量 60%甘油 4保存； 不宜加 NaN3 或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以 BSA 或脱脂牛奶作保护剂。 程序二： （1）将 5mg HRP 溶于 0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入 1%二硝基氟苯无水乙醇溶液 0.1ml，室温搅拌作用 1 小时，以封闭 HRP 分子上的 和 氨基。 （2）再加 1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅 30 分钟，溶液呈黄绿色；随后加 1ml 0.06mol/L 乙 二醇，轻搅 1 小时，中止氧化反应。 （3）移入透析袋中，在 1000ml 0.01mol/L PH9.5 碳酸盐缓冲液中，4透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。 （4）吸取上述醛化好的 HRP 溶液 3ml，加入 5mg IgG 的碳酸盐缓冲液 1ml，室温轻搅 2-3 小时，避光；加入 5mg NaBH4 ，4放置 3 小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用 7 小时。 （5）再移入透析袋中，在 0.02mol/L PH7.4 PBS 中透析 24 小时，更换三次缓冲液。 （6）用 3000r/min 离心 30 分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许 PBS 溶解，透析或 层析除盐，必要时进一步层析纯化。 （7）、（8）步骤同程序一。 2、碱性磷酸酶（AP）标记 碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的 NH2 分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序 如下： （1）将 5mg AP 加入 1ml 抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于 4对 0.01mol/L PH7.2 PBS 透析 18 小时， 换液三次。 （2）加入 2.5%戊二醛 20ul，室温作用 1-2 小时，4对 PBS 透析过夜，其间换液三次。 （3）换用 0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl 缓冲液透析，4过夜，换液三次。 （4）取出标记抗体，用含 1%BSA 的 Tris-HCl 缓冲液稀释至 4ml，即为 AP 标记物原液。 （5）每毫升中加入 0.4ml 甘油，小量分装，保存备用。 3、PAP、APAAP 的制备 PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术）、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术）的制备对于日 益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔 PAP、APAAP 试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为 PAP 法和 APAAP 法不用任何化学交联剂处理酶 和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP 和 APAAP 试剂的制备方法常采用先将 HRP 或 AP 加入抗 HRP 或 AP 的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解 离反应，调 PH 至 2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化 PAP 或 APAAP。 根据需要还可将 PAP 和 APAAP 试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一 步法用于诊断或检测试验等。 二、荧光素标记 1、异硫氰酸荧光素（FITC）标记 FITC 标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与 IgG 的自由氨基结合，形成 IgG 与荧光素的结合物。 FITC 是最常用的荧光素，其次选用 TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC 和 TRITC 是常用的双标记组合。其标记 步骤如下： （1）以碳酸盐缓冲液（PH9.3，Na 2CO3 8.6g，NaHCO 3 17.3g，蒸馏水 1000ml）调整抗体浓度至 10mg/ml。 （2）取 5ml 抗体溶液置于 10ml 小烧杯中。 （3）称取 1mg FITC 溶于 0.2ml DMSO 中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅；其后室温避光作用 2 小时。 （4）将交联物经 Sephadex G25 或 G50 柱层析除去游离的荧光素；分管收集第一峰为标记的抗体。 （5）FITC 的结合物质量鉴定 IgG 量（mg/ml）=（OD280-OD4950.35）/1.4 F/P=2.87OD495/（OD280-OD4950.35），一般说，FITC 对抗体的摩尔比为 3：1 时适合于组织切片染色，为 5- 6：1 时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。 （6）标记抗体的保存：宜保存于 4，加 NaN3防腐。 2、异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记： 基本与 FITC 标记相同。 三、同位素标记 必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应包括避免物理 的接触和对 -射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废 料。 1、碘标记 用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I 衰变产生低能的 和 射线，很容易被检测出来，而其 60 天的半衰 期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。最常用的碘标记方法是氯胺 T 法，即将氧化剂氯胺 T 加入 到抗体和碘化物的溶液中，Na125I 在氯胺 T 作用下 I 转化成 I2，游离 I2 可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生 卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其主要操作 步骤如下： （1）在进行标记之前，先选用截流分子量为 20000-50000 的凝胶，制备 1ml 凝胶柱，然后分别用 10 倍体积的 1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和 PBS 洗涤柱体，封住柱下口，备用。 （2）加入 10ug 纯化单抗至含有 25ul 2.5mol/L 磷酸钠（PH7.5）的 1.5ml 指形管内。随后，加入 500uCi Na125I 混匀。 （3）加入 25ul 新配制的 2mg/ml 氯胺 T。室