实验九 微生物的大小及数量测定

实验九 微生物的大小及数量测定 摘要 通过显微测微尺测量酿酒酵母的长和宽，对其细胞体的大小有一个具体的 了解；使用血球计数板对稀释 n 倍的酵母菌悬液进行细胞数量的测定，从而达 到定量了解微生物的生长繁殖情况。 关键词 目镜测微尺 物镜测微尺 血球计数板 前言 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据 之一，也让我们对微生物的实际大小有了一个感性的认识。微生物数量的测定 在微生物生长曲线中运用非常重要，我们从微生物的数量上了解其生长状况， 这也能指导我们的工业生产。 一、实验目的 1、 掌握测微尺、血球计数板的使用方法； 2、 掌握微生物数量大小及数量测定方法。 二、实验原理 （一）微生物大小的测定 微生物细胞大小，是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。 由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用来测量微生物细胞大小的工具有目镜 测微尺和镜台测微尺。 镜台测微尺（图 1a）是中央部分刻有精确等分线的载玻片。一般将 1mm 等 分为 100 格，每格长度等于 001mm（即 106m）。镜台测微尺并不直接用来 测量细胞的大小，而是专用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 目镜测微尺（图 1b）是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中 央刻有精确的刻度，有等分 50 小格或 100 小格两种，每 5 小格间有一长线相隔。 由于所用目镜放大倍数和物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实 际长度也就不同。因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小。在使用 前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该 目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。 图 1 测微尺及其安装和校正 （二）微生物数量的测定 显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确 定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)-显微镜下直接计数的一种简便、快 速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血球计数板、Peteroff- Hauser 计菌器以及 Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢 子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容 积为 0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有 0.02mm，因此可用油浸 物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在 显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳 的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此 法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方 法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分 裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验用血球计数板进行显 微镜直接计数。 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。 该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽，构成三个平台；中间较宽 的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个 方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造 如图 2。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成 25 个中方 格，而每个中方格又分成 16 个小方格；另一种是一个大方格分成 16 个中 方格，而每个中方格又分成 25 个小方格(图 2)，但无论是哪一种规格的计 数板，每一个大方格中的小方格都是 400 个。每一个大方格边长为 1mm，则 每一个大方格的面积为 1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度 为 0.1mm，所以计数室的容积为 0.1mm3(万分之一毫升)。 计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值， 再乘上 25 或 16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成 1ml 菌液中 的总菌数。 25 个中方格的计数板，设 5 个中方格中的总菌数为 A，菌液稀释倍数 为 B，则：1mL 菌液中的总菌数=A/52510 4B=50000AB（个）同理， 16 个中方格的计数板，1mL 菌液中的总菌数 =A/516104B=32000AB（个） 。 图 2 血球计数板构造示意图 三、实验材料 1、菌种 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae） 2、仪器 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板，盖玻片，吸水纸，计数器、 滴管，擦镜纸，酒精灯，接种环，试管等。 3试剂 5%孔雀绿水溶液，香柏油，二甲苯，蒸馏水等。 四、实验步骤 1、目镜测微尺的校正及酵母大小的测定 A 目镜测微尺的校正 目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上， 把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中 看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行， 移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找 两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测 微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每小格长 l0m，所以由下列公式可以算 出目镜测微尺每小格所代表的长度。 目镜测微尺每格长度（ ） =两重合线间镜台测微尺的格数 10两重合线间目镜测微尺的格数 用此法分别校正在物镜倍数为 10，40，100下目镜测微尺每小格所代 表的长度。 注意事项 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特 定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的 情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测 微尺每一格所代表的长度。 B 酵母大小的测定 1) 制片：在载玻片中央滴一滴蒸馏水，用接种针在酵母菌悬液中蘸一下，涂 到蒸馏水中，干燥固定（自然干燥或在酒精灯上方来回移动载玻片），用孔 雀绿染液覆盖涂菌部位 1.5min2min，自来水冲洗掉孔雀绿染液，对载玻 片进行干燥。 2）酵母大小测定：移去镜台测微尺，换上酵母菌装片，先在低倍镜下找到目的 物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不 足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的 校正值，即等于该菌的长和宽。 3)由于不同细胞之间存在个体差异，在测定菌体细胞大小时随机选取三个细胞 进行测量，然后计算平均值。 4)同样的方法，分别在 40 倍物镜和油镜下测定酵母菌的大小。 注意事项 测量菌体大小时要在同一个标本片上测定 3 个大小相近的菌体，求出平均 值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。 测量完毕后取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台 测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。 2、酵母菌数量测定 (1)取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。 (2)将酵母菌菌悬液充分摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽 内沿盖玻片的右上角滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片之间自行渗入 计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。 (3)先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。 (4)计数时用 25 中格的计数板，要取上、下、左、右、中的 5 个中格(即 80 小 格)的酵母菌数。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦 距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防 止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数 右线，以减少误差。 (5)样品最好重复计数 2-3 次(每次数值不应差过大，否则应重新操作)，取其平 均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数（25 中格） 。 (6)血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以 免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。 五、实验报告 1、实验结果 （1）校正目镜测微尺 目镜测微尺校正结果 物镜 物镜倍数 目镜测微尺格数 镜台测微尺格数 目镜测微尺每格 代表的长度/m 低倍镜 10 25 49 19.6 高倍镜 40 25 12 4.8 油镜 100 21 4 1.9 注：目镜放大倍数为10倍。 （2）酿酒酵母大小测定 长 宽 目镜 目镜测微尺 每格代表的 长度/m 所占格数 平均/m 所占格数 宽度/m 菌体大小 0.9 0.6 0.8 0.7 40 倍物 镜 4.8 0.7 0.6 2.0 1.2 1.2 1.1油镜 1.9 1.2 3.51 0.6 2.54 3.51m 2.54m （3）酿酒酵母计数结果 各中格酵母菌数稀释倍 数 B 1 2 3 4 5 5个中格总酵母菌 数 A 1ml 菌液中酵母菌 数 4 86 97 79 92 85 439 8.78107 2.思考题 （1）为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜，必须用镜台测微尺重新对目镜测 微尺进行调节？ 答：由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特 定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定 的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目 镜测微尺每一格所代表的长度。 （2）在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌 的大小时，其测定结果是否相同？为什么？ 答：在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌 的大小时其结果不相同，因为物镜放大倍数不同，使得目镜测微尺每格代表 的数值不同，精确度不一样，因此数值不同。 （3）结合实验体会，总结哪些因素会造成血细胞计数板的计数误差，应如何避 免？ 答：血细胞计数板计数时的误差来源： 计数室内有气泡将影响菌悬液随机分布 而使计数产生误差，并且改变了菌悬液的总浓度（因为气泡占有一定的体积， 使计算结果偏低）；重复计数或遗漏。遇到有出芽的酵母菌计为两个。吸取 菌液前，将酵母菌菌悬液充分摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两 侧的沟槽内沿盖玻片的右上角滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片之间 自行渗入计数室，勿使产生气泡；菌体在计数室中处于不同的空间位置，要 在不同的焦距下才能看到，观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌 体，防止遗漏。 六、实验分析 在测量细菌大小的实验中，菌体的大小随菌龄和环境条件而异,或读数不准 确均会造成误差。在显微镜计数的实验中，对菌液稀释时稀释倍数的不准确把 握和实验的重复次数较少都会影响实验结果。 在对酵母菌菌悬液进行计数前，应该要静置一会儿，以免测定时菌体还在 移动。并且，应该要用镊子轻轻的压盖玻片，以免每个小格里的微生物过饱和， 给计数带来误差。计数时，第一次每格中的菌数过多，我们将菌悬液稀释后再 用血球计数板进行计数，所得每小格中的菌数在正好在做要求的范围内，这样 对于计数，既准确又方便。 七、实验小结 在对目镜测微尺进校正的时候，不同的倍数需要分别校正。但是也正是由 于放大的倍数不一样，是使在校正的时候镜台测微尺的刻度线不断放大，也