兔抗人红细胞免疫血清的制备

兔抗人红细胞免疫血清的制备 摘要：目的 制备兔抗人红细胞免疫血清并鉴定其效价。方法 将 经过生理盐水洗涤、离心、去上清后配成的红细胞悬液皮下多点 （10 处）注射于家兔靠近淋巴结处，在 20 天内经过免疫间隔时间 的不同后，心脏采血并分离血清，倍比稀释、经过灭火补体与不灭 活补体的凝集试验和溶血试验来判断兔抗人红细胞免疫血清的效价。 结果 凝集试验在(+)1:64 抗血清稀释处出现凝集,溶血试验在 1:512 稀释处出现少量凝集。结论 在凝集试验中抗血清的效价为 1:64. 关键词：兔抗人红细胞血清 凝集试验 抗体分子是生物学和医学领域用途最广泛的蛋白质分子，抗体作为 疾病预防、诊断和治疗的重要生物制剂已有百余年历史。抗体在医 药生物技术领域中的应用日趋广泛，地位越来越重要，而抗体的制 备技术也是众多研究者们关注的问题，目前制备多克隆抗体主要是 通过免疫动物所得，但是怎样才能制备得到高效价的抗体呢，免疫 血清效价的高低受多重因素的的影响，免疫的途径及免疫的时间不 同和分离的彻底与否都会影响抗血清的效价。本组通过免疫时间的 不同来免疫家兔，并用 凝集实验和溶血试验来判断抗体效价，快速 经济的制备抗血清制备方法为实验教学使用提供帮助， 更好的了解 和加深抗原抗体反应及抗体效价的鉴定和影响因素 。 1 材料和方法 1.1 实验对象 选用健康、适龄、健壮、无感染的家兔 1.2 实验材料 生理盐水 人红细胞 采血针 止血带 碘液 酒精 棉签 真空管 水平式离心机 水浴箱 注射器 试管 吸管 实验分组 三个大组（1 个班一个大组） 4 人一组 实验过程和方法 1、颗粒性抗原的制备 （2%5%RBC 的制备） （1）静脉采血 2-3ml，注入抗凝管中，轻轻混匀。 （2）洗涤 RBC 将上述抗凝血移至 10ml 试管中，加入 NS 6- 7ml，混匀， 2500r/min 离心 5min,去上清。重复上述操作三次，最 后一次去上清后，将红细胞配制成 2%5%的 RBC 悬液。 二 免疫家兔 2、取上述 RBC 悬液 1ml 免疫家兔。免疫部位：静脉、皮内、皮下 等。每只兔子免疫 810 点，每点 0.1ml 左右。每隔 24 天免疫一次。 1 班免疫时间表：从 11 月 1 日起开始免疫 共 20 天 每隔 2 天免疫 一次 第一次：11 月 1 日 第二次 ：11 月 4 日 第三次：11 月 7 日 第四次： 11 月 10 日 第五次 ：11 月 13 日 第四次：11 月 16 日 第七次：11 月 19 日 2 班免疫时间表:每隔 3 天免疫一次 第一次：11 月 2 日 第二次：11 月 6 日 第三次：11 月 10 日 第四次：11 月 14 日 第五次：11 月 18 日 第六次：11 月 21 日 3 班免疫时间表：每隔 4 天免疫一次 第一次：11 月 3 日 第二次：11 月 8 日 第三次：11 月 13 日 第四次：11 月 18 日 第五次：11 月 22 日 三、对已免疫的家兔心脏采血和分离血清 3、心脏采血 10ml，凝固后，分离血清（2000 转/min,5 分钟)。 4、取两支小试管并以 A、B 标记之，将上述血清一半加入 A 管，另 一半加入 B 管。将 A 管置于 56水浴箱 30 分钟（灭活补体） 。 5、抗血清效价的鉴定。 凝集试验和溶血反应 凝 集 反 应 实验原理 指颗粒性抗原(RBC)与相应抗体特异结合， 在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象 试管凝集试验过程 1.取洁净小试管 10 支，排列于试管架上，依 次编号。 2.向各管中加入生理盐水 200ul。 3.向第一支试管中加入 A 管血清 200ul，充分混匀，吸出 200ul 放入 第二管，混匀后取出 200ul 加入第三管中，如此类推直至第七管， 混匀后取出 200ul 弃去。第 10 管不加血清，为生理盐水对照管。至 此，第 19 管的血清稀释度分别为： 1：2，1：4，1：81：512。这种稀释方法称为连续倍比稀释法， 为免疫试验中常用的稀释方法。 4.向每管加入 200ul 2%RBC 悬液，此时每管的液体总量为 400ul ， 血清稀释度又增加 1 倍。 5.摇匀，置 37 30min。(取出试管 1500r/s 30 秒)观察结果。 试管凝集操作程序(倍比稀释法) 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NS 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 血清 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 RBC 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 终稀释度 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 - 结果判断 选择适当的光暗对比背景，先不要振摇，观察管底凝集物的范围和 上清液的浊度。然后轻轻摇动试管，注意观察凝集颗粒的大小、均 匀度等。每一试管的观察，都应与对照管进行比较。盐水对照管诮 无凝集现象，轻轻摇动试管则 RBC 分散成均匀混浊；而凝集块则沉 于管底，轻摇时不易散开，凝集程度通常以“+”表示： “4+”很强，全部 RBC 凝集，凝集块全部沉于 管底，液体 澄清。 “3+”强，RBC 大部分凝集并沉于管底，液体稍混浊。 “2+”中等强度，RBC 大约一半凝集，液体较混浊。 “+”弱，仅少量 RBC 凝集，液体明显混浊。 “-”不凝集，液体混浊与对照管相同。 只要待测血清管出现“2+”以上的凝集现象，即可判断为反应阳性； 以出现“2+”凝集的最大稀释度为待测血清的抗体效价。 溶 血 试 验 实验原理 溶血反应是指补体参与的抗体致红细胞的溶解反应. 参与反应的成分有红细胞、抗红细胞抗体，也称溶血素、补体。 溶血反应实验过程 1.取洁净小试管 8 支，排列于试管架上， 依次编号。 2.向各管中加入生理盐水 200ul 3.向第一支试管中加入血清 200ul，充分混匀，吸出 200ul 放入第二 管，混匀后取出 200ul 加入第三管中，如此类推直至第七管，混匀 后取出 200ul 弃去。第八管不加血清，为生理盐水对照管。至此， 第 17 管的血清稀释度分别为：1：2，1：4，1：81：128。这 种稀释方法称为连续倍比稀释法，为免疫试验中常用的稀释方法。 4.向每管加入 200ul 2%RBC 悬液，此时每管的液体总量为 400ul ， 血清稀释度又增加 1 倍。 5.摇匀，置 37 30min。观察结果。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NS 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 血清 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 RBC 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 终稀释度 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 - -观察结果时，应先观察对照管结果是否正确。对照管应不溶血， 在对照管结果全部正确前提下观察待测血清管的结果，以出现完全 溶血作为抗体的效价。 6 结果 经统计 1、2 班凝集试验抗血清最高效价为 1:512。 本班本组凝集试验结果：在 1:41:128 血清稀释度 处均出现凝集 现象，1:128 稀释度处 仅有少量凝集为“+”而 1：64 处有一半凝集， 液体较浑浊，而空白对照管中无凝集现象产生，通过目测， “+”为 稀释度 1:64 处，则抗血清的效价为 1:64。 7 讨论 本班鉴定的抗血清效价都比 1、2 班的都低，造成这样的结果 可能 是因为 1、免疫间隔时间较长，是家兔机体产生的抗血清较少 2、免疫部位的不同以及免疫不到位 3、操作过程不够认真，分离得到的抗血清不够纯 4、凝集试验过程中 灭火补体时间不够，导致部分被溶血而使凝集 的很少 5、免疫兔子腹部淋巴结时，针头穿进腹膜下进到腹腔而使部分血清 被消化排除使家兔的免疫应答减弱而产生的抗体少 6、免疫兔子时针头穿破皮肤而未发觉 造成血清注射量减少造成抗 体产生减少 参考文献 何艳嫦 钟俊东