性激素通过il-1_il-1r通路促进原发性肝癌的机制的研究性激素通过il-1_il-1r通路促进原发性肝癌的机制的研究

修改意见： 性激素通过 IL-1/IL-1R 通路促进原发性肝癌的机制的研究 摘要目的 探讨雌激素 E2(Estradiol，E2) 是否对原发性肝癌的发生发展有促进作用， 以及该作用机制是否通过白细胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)/ 白细胞介素-1 受体 （Interleukin-1 receptor，IL-1R）通路。方法 选取我院 2013 年 1 月至 2014 年 6 月接收的 原发性肝癌男性患者作为观察组，选取同期接收的非原发性肝癌患者作为正常对照组，分 别采用 ELISA 法检测两组患者血清中的 E2、IL-1 和 VEGF 浓度，采用 Western blot 法检 测两组肝肿瘤组织和正常肝组织中 E2R 和 IL-1R 蛋白表达水平。 结果 观察组患者血清 中 E2、 IL-1 和血管内皮生长因子( Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)浓度显著性 高于正常对照组，且两组间比较具有显著性差异（P0.01） ；观察组肿瘤组织中 E2R 和 IL- 1R 蛋白表达水平显著性高于正常对照组，且两组间比较具有显著性差。异（P0.01） 。 结论 E2 对原发性肝癌的发生发展具有促进作用，且改作用机制可能是通过上调 IL-1/IL- 1R 通路，促进 VEGF 的表达，引起肿瘤血管的形成而完成的。 关键词 雌激素；白细胞介素-1；白细胞介素-1 受体；原发性肝癌 中图分类号 TQ460. 7 文献标识码A Mechanism of primary liver cancer promoting hormone pathway through IL- 1/IL-1R Abstract Objective To investigate whether estrogen E2 (Estradiol, E2) for the development of primary liver cancer are promoted, as well as the mechanism of action is through interleukin -1 (Interleukin-1, IL-1) / IL 1 receptor (Interleukin-1 receptor, IL-1R) pathway. Methods Selected male patients with primary liver cancer as the observation group of our hospital from January 2013 to June 2014. Selected the same period of non-primary liver cancer patients as normal control group, the patients were detected by ELISA serum E2, IL-1 and VEGF concentrations were detected by Western blot in liver tumor tissue and normal liver tissue and IL- 1R E2R protein levels. Results Serum observation group E2, IL-1, and vascular endothelial growth factor (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) were significantly higher than the normal control group, and between the two groups was significant difference (P 0.01); Observer Group E2R tumor tissue and IL-1R protein levels were significantly higher than the normal control group, and between the two groups was significant difference (P 0.01). Conclusion The development of E2 to promote the role of primary liver cancer, and the mechanism of action may be changed by upregulating IL-1/IL-1R pathway promotes the expression of VEGF, causing the formation of tumor blood vessels and completed. Keywords estrogen; interleukin-1; interleukin-1 receptor; primary liver cancer 原发性肝癌是临床中较为常见的恶性肿瘤，在世界各国的发病率都非常高 1。在我国 原发性肝癌是临床发病率最高的恶性肿瘤之一，原发性肝癌在男女人群中有着非常特殊的 规律，男性人群的发病率远远大于女性人群的发病率，男女比例达到 7:12。已有研究表 明肝癌的发生与体内的激素水平的高低异常有着密切的关系，肝癌的发生、发展以及肝癌 的生物学特性的变化与肝癌组织中性激素受体表达的低下有关，导致了男性人群中患有原 发性肝癌的机率远远大于女性人群 3,4。癌细胞的转移在癌症的发生发展过程中起着极其 重要的作用，而癌细胞的转移又是一个极其发展的过程，包括多个环节，如恶性肿瘤早期 的生长、血管在肿瘤中的新生、肿瘤细胞的脱落、脱落后的肿瘤细胞入侵到新的基质中、 在新的组织器官中生长等等 5,6。在这些极其发杂的环节中癌细胞的转移是在多种细胞因 子的调控下完成的，如白细胞介素-1（IL-1） ，今近来研究表明 IL-1 与肝肿瘤的转移有着 密切的关系，IL-1 的异常升高可以促进原发性肝癌症的发生发展 7。 目前上没有文献报道雌激素是否通过 IL-1/IL-1R 通路拮抗原发性肝癌的研究。本研究 观察原发性肝癌患者组织或血清中雌激素及其受体、IL-1 及 IL-1R，以及相关指标， 来探究性激素是否通过 IL-1/IL-1R 通路拮抗原发性肝癌和该通路的相关分子机制。 1 材料与方法 1.1 一般材料 选取 2013 年 1 月至 2014 年 6 月南方医科大学南方医院接受手术切除的原发性肝癌患 者 33 例作为观察组（所用患者均经病理证实） ，为避免女性患者经期体内性激素的变化对 研究的影响，所有的研究对象均为男性，年龄为 34 岁至 78 岁，平均年龄为 51.24.6 岁， 所用患者在研究前均未接受任何的放疗和化疗；另外取同期我院接受的 18 例非原发性肝癌 患者（11 例为肝外伤患者，7 例为肝脏内胆管结石患者）作为正常对照组，其中男性 18 例， 年龄 33 岁至 75 岁，平均年龄为 50.33.7 岁。患者均签署了知情同意书。本实验经过南方 医科大学南方医院伦理委员会审核通过。所有研究对象均清晨空腹采集静脉血保存于-20 冰箱中，观察组合正常对照组所采集的肿瘤和正常肝组织保存于-80冰箱中。对所用研究 对象排出标准为：有严重的心脑血管疾病患者，有酒精性肝病和脂肪肝患者，患有原发性 胆汁肝硬化和肝硬化性胆管炎患者，接受抗病毒治疗的患者。 1.2 主要试剂与仪器 雌二醇、VEGF、IL-1 酶联吸附检测试剂盒（购自上海绿叶生物技术有限公司，批 号分别为 140311、140402、140423） ，雌激素受体（E2R）一抗，白介素-1（IL-1 R）一 抗为兔抗人（购自武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为：03120514、0312010415） ， 雌激素受体（E2R）二抗，白介素 -1（IL-1R）二抗为羊抗兔（购自 Chemicon 公司，批 号分别为 5520836784、0603067823） ，Centrifuge 5417R 型离心机（Eppendorf） ，酶标仪 （BioTek SYNERGYTM4） ，垂直电泳仪（ Bio-Rad） 。 1.3 方法 1.3.1 血清中 E2、VEGF 和 IL-1 浓度检测 分别将观察组合正常对照组患者清晨空腹采集的静脉血用离心机离心分离血清，离心 条件为 3500r/min 转速，10min 离心时间，分离得到的血清按照酶联吸附检测试剂盒说明 书操作检测观察组合正常对照组患者血清中的雌二醇、VEGF、IL-1 的浓度。 1.3.2 组织中 E2R 和 IL-1R 蛋白表达水平的检测 分别将从观察组合正常对照组患者采集的肿瘤和正常肝组织用匀浆器加 RIPA 匀浆裂 解，分离得到的组织提取上清液和 loading buffer(5)按照 4:1 的比例混和煮沸，用垂直电 泳仪电泳分离组织提取上清液中的目的蛋白，待目的蛋白充分分离后再将目的蛋白转移到 硝酸纤维素膜中；转移后在 5%脱脂奶粉中封闭两小时； PBST 反复洗膜 3 次，10min/次； 加入 E2R 和 IL-1R 一抗，稀释 1000 倍，在 4冰箱中过夜孵育； PBST 反复洗膜 3 次， 10min/次；在二抗稀释 2000 倍在常温孵育 1 小时；在目的蛋白相应的位置涂布 ECL，在暗 室中曝光成像到胶片中；扫描分析个目的蛋白的条带灰度值。 1.4 统计学方法 所得到的研究数据均以 s 表示，应用 SPSS17.0 统计软件对所得到的研究数据进行x 统计分析，组间比较采用 t 检验，用 P0.01 作为判定差异具有统计学意义的依据。 2 结果 2.1 血清中 E2、VEGF 和 IL-1 浓度的浓度 观察组中原发性肝癌患者血清中的 E2、VEGF 和 IL-1 浓度均分别显著高于正常对 照组患者血清中的 E2、VEGF 与 IL-1 的浓度，且两组间的差异具有统计学意义，即 P0.01。结果表明原发性肝癌患者体内 E2、VEGF 、IL-1 合成分泌量均有升高。具体结 果见表 1。 表 1 两组血清中 E2、VEGF 、IL-1 浓度检测结果（ s, pg/ml）x Tab.1 Two groups of serum E2, concentration of VEGF, IL - 1 beta test results ( s，pg/ml)x 组别 例数 E2 VEGF IL-1 正常对照组 18 25.17 6.98178.13 50.4115.11 3.09 观察组 33 43.18 9.01# 432.74 74.19# 30.21 5.76# #P0.01，与正常对照组比较，compared with control group 2.2 组织中 E2R 蛋白表达水平 观察组中原发性肝癌患者肿瘤组织中的 E2R 蛋白表达量显著高于正常对照组患者正常 肝组织中 E2R 蛋白表达水平，且两组间的差异具有统计学意义，即 P0.01。结果表明原发 性肝癌患者肝肿瘤组织中的雌二醇受体表达量增加。具体结果见图 1。 图 1.两组组织中 E2R 蛋白表达水平 1. 正常对照组；2.观察组 #P0.01，与正常对照组比较 Fig.1 protein levels of E2R in two in groups 1. Control group; 2. Observer group #P0.01, compared with control group 2.3 组织中 IL-1R 白表达水平 观察组中原发性肝癌患者肿瘤组织中 IL-1R 蛋白表达量显著高于正常对照组患者正 常肝组织中 IL-1R 蛋白表达水平，且两组间的差异具有统计学意义，即 P0.01。结果表 明原发性肝癌患者肝肿瘤组织中的白细胞介素-1 受体表达量增加。具体结果见图 2。 图 2.两组组织中 E2R 蛋白表达水平 1.正常对照组；2.观察组 #P0.01，与正常对照组比较 Fig.2 protein levels of E2R in two in groups 1. Control group; 2. Observer group #P0.01, compared with control group 3 讨论 肝癌的发病率极高，在恶性肿瘤中排第 5 位。原发性肝癌的发生发展如同其他癌症 是一个极为发杂的多环节过程，其发病原因多样，如病毒感染、黄曲霉毒素导致肝脏损伤、 酒精导致肝脏损伤、肝硬化、体内激素异常 8。近年来临床观察统计结果发现原发性肝癌 的男性患者的发病率远远高于女性患者的发病率，这一结果逐渐引起人们注意，性激素异 常与肝癌的发生发展逐渐成为研究的热点，研究表明体内性激素水平的失常可以引起体内 细胞生物学的异常，进而会导致肿瘤的发生。性激素与存在体内的多种亚细胞器上的相应 的受体结合，进而可以调节细胞多种生理生化过程，包括免疫反应、多种细胞的凋亡和增 值 9。有研究表明雌激素受体（ER ）mRNA 在肝癌组织中的表达阳性率远远大于在正常肝 脏组织中的阳性表达率。ER 与 ER 是雌激素受体（ER）的两个亚型，两者的功能既有 共同性又有差异性，ER 可以通过调节肝癌肿瘤细胞的增值而影响肝癌患者的恶性肿瘤的 发生与发展 10,11。张燕 4等研究发现在肝癌肿瘤组织中 ERmRNA 的阳性表达率显著性的高 于原来肝癌肿瘤组织的正常肝组织，并且 ERmRNA 阳性表达率和肝癌患者的肝肿瘤的分 化程度高低、患者性别、肝肿瘤的直径大小存在密切关系，特别是在男性患者中 ERmRNA 的阳性表达率显著的高于女性患者。 在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤的转移是一个必不可少的环节，肿瘤的转移是一个复 杂的过程，涉及到多个过程，其中肿瘤血管的新生和粘附分子的表达是肿瘤转移的关键环 节 12,13。肿瘤血管的形成可以为肿瘤细胞转移至新环境提供生长所必须的营养物质和氧气， 并且还可以为肿瘤细胞的转移提供转移通道，肿瘤血管形成的程度高低已经成为评定恶性 肿瘤严重程度的一个重要指标 14。IL-1 是当机体发生感染或产生炎症时体内产生的具有多 种生物学功能的细胞因子，IL-1 产于机体的炎症反应、免疫调节、机体代谢调节等， IL-1 有两种亚型，即 IL-1 和 IL-，两者虽然基因序列大部分不同，但生物学功能却有相似之 处。已有研究表明 IL-1 可以促进肿瘤血管的形成，Elena 15等研究发现把含有肿瘤细胞的 基质胶接种到敲除 IL-1 基因的小鼠和未敲除 IL-1 基因的小鼠的肩胛区，结果发现未敲 除 IL-1 基因的小鼠的接种的基质胶中新生血管的密度显著性的高于敲除 IL-1 基因的小 鼠，并且在未敲除 IL-1 基因的小鼠的接种的基质胶中 VWF 表达量显著性高于敲除 IL-1 基因的小鼠，这一结果表明 IL-1 可以促进肿瘤血管的形成。 本研究结果表明原发性肝癌患者血清中 E2、IL-1 和 VEGF 的浓度显著性高于正常对 照组，肝癌组织中 E2R 和 IL-1 表达量显著性高于正常肝组织。分析表明 E2 可以促进肝 癌的发生，其机制可能是通过上调 IL-1 的分泌量和 IL-1 受体表达水平，进而上调肝肿 瘤 VEGF 的表达，促进肿瘤血管的形成，促进肿瘤转移，最终促进原发性肝癌的发生与发 展。这一结果的发现为原发性肝癌采用抗雌激素治疗提供了新的理论依据。 参考文献 1 何立丽,吕文良,孙桂芝 .中药提取物抗原发性肝癌的研究进展J. 中华中医药杂志, 2014,4(29):1175-1178. 2 W. 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