慢性阻塞性肺疾病老年患者支气管肺泡灌洗液中细胞、白介素-8变化的临床意义

老年慢性阻塞性肺疾病患者支气管肺泡灌 洗液中细胞、白介素-8 变化的临床意义 【摘要】 目的： 观察老年 COPD 患者支气管肺泡灌洗液 （Bronchoalveolar lavage fluid, BALF）中的细胞学、IL-8 水平变化。探讨在老 年 COPD 发病及病情演变过程中炎性细胞及 IL-8 的作用和临床意义。 方法: 选取 2013 年 10 月至 2014 年 3 月我院 COPD 患者 31 例（男 26 例，女 5 例， 年龄 60-80 岁）为实验组，对照组（无急、慢性气道疾病史，影像学无异常） 10 例（男 6 例，女 4 例，年龄 60 -70 岁） 。根据中华医学会呼吸分会慢性阻塞 性肺疾病诊治指南（2013 年修订版） ，将实验组分为 COPD 急性加重期组 （n=15 ）,COPD 稳定期组（n=16） ，又进一步将 COPD 患者（n=31 ）分为吸烟 组（n=25 ）和不吸烟组（n=6 ） 。行支气管肺泡灌洗（ Bronchoalveolar lavage，BAL ） ，采用瑞氏染色法对实验对象 BALF 细胞进行分类比较，并采用 双抗定量夹心酶联免疫吸附法测定 BALF 中 IL-8 水平。 结果：（1） COPD 急性加重期组 BALF 中嗜中性粒细胞（ NEU）及嗜酸性粒细胞（EOS）比率 （55.4324.31%,9.308.11%）,稳定期组（28.9820.43% , 2.221.13%）和对照 组（2.251.21% , 0.480.62%） ，三组比较差异显著（P 均0.05） 。 （2）COPD 急性加重期组、稳定期组和对照组 BALF 中 IL-8 水平分别为 112367.33 pg/ml、 855197.17 pg/ml 和 208.2177.65 pg/ml，三组显著性差异（P 均0.01 ） 。 （3）本组实验 IL-8 与 NEU 比率呈正相关（r=0.865,P0.01） ，与 FEV1 呈负相 关（r=-0.628,P=0.004） 。FEV 1 与 NEU 以及 EOS 呈负相关（r=- 0.958,P0.01；r=-0.881,P0.01） 。 （4）COPD 吸烟组 BALF 中 IL-8 水平 （1060.16126.55pg/ml）明显高于不吸烟组（680.33165.52pg/ml），差异具有 统计学意义（P0.01） 。结论 ：NEU、EOS 和 IL-8 参与了气道炎症反应，可能 可用来判断疾病程度。检测 IL-8、NEU 和 EOS 可能对明确老年 COPD 发病机 制有指导意义,判断治疗效果和预后。 【关键词】慢性阻塞性肺疾病，白介素-8，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞 , 支气管肺泡灌洗 ， 支气管肺泡灌洗液 作者单位：300052 天津医科大学总医院高干病房 The clinical significance of bronchoalveolar lavage cells and IL-8 levels in gerontal patients with chronic obstructive pulmonary disease 【Abstract】Objective: To observe the variation of cytology and IL-8 in the bronchoalveolar lavage fluid of gerontal patients with COPD. Illminate the role and clinical significance of the cytokines in the pathogenesis and progression of COPD of the aged. Methods: Thirty-one patients diagnosed as COPD in our hospital from Oct. 2013 to Mar. 2014 and the control group (n=10) were chosen in experimentation. The experiment group was composed of the elderly patients diagnosed as COPD and divided into two groups, exacerbation group (n=15) and stable group (n=16). And the COPD group was divided into two groups by ciggrate. Take the bronchoalveolar lavage fluid from 15 acute exacerbation of COPD patients、16 stable COPD patients and 10 controls. After that , centrifugate to have the bronchial lavage fluid supernatants and cytological compostition. To smear cell with centrifuge film preparation method, staining with HE, cytologic categorization by microscope. To observe the expression of IL-8 in the bronchoalveolar lavage fluid by Enzyme linked immunosorbent assay. Results: (1) The neutrophil and eosinophil in BALF of acute exacerbation 、stable COPD group and control group were (2.251.21% , 0.480.62%)、 (28.9820.43% , 2.221.13%)、(55.4324.31%,9.308.11%)respectively. The neutrophil and eosinophil of acute exacerbation and stable COPD group were significantly higher than control group(P0.05). (2) IL-8 in BALF of acute exacerbation 、stable COPD group and control group were 112367.33 pg/ml、 855197.17 pg/ml 和 208.2177.65 pg/ml，respectively. IL-8 of acute exacerbation and stable COPD group were significantly higher than control group(P0.01). (3) Positive correlation was obtained between IL-8 and neutrophil ratio( r=0.865, P0.01), and negative correlation between IL-8 and FEV1 ( r=- 0.628,P=0.004). There was negative correlation between FEV1and neutrophil and eosinophile granulocyte in BALF( r=-0.958, P0.01; r=-0.881, P0.01). (4) The level of IL-8 in BALF of smoking group(1060.16126.55pg/ml) was significantly increased than the group non-smoking (680.33165.52pg/ml) (P0.01). Conclusions: The results show us that neutrophil、eosinophil and IL-8 taked part in the airway inflammation of COPD. To detect neutrophil、eosinophil and IL-8 may be a much better method for identifing the pathogenesis and reflecting the progression of local inflammation in COPD patient ,besides, to observe the level of IL-8 and cytological change plays an important role in the diagnosis and prognosis of COPD of the aged . 【Keywords】chronic obstructive pulmonary disease , interleukin-8, neutrophil , eosinophile granulocyte，bronchoalveolar lavage , bronchoalveolar lavage fluid 慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗 的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体 或有害颗粒的异常炎症反应有关。越来越多的研究证明，COPD 与气道、肺实 质和肺血管慢性炎症反应相关，中性粒细胞在 COPD 患者气道分泌物中比率明 显升高 16，且嗜酸性粒细胞在 COPD 患者气道中已经被检测到 79，更有学者 认为气道阻塞的程度与支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid, BALF）中的嗜酸细胞以及中性粒细胞浸润程度有关 1013。且近年来随着对气 道炎症机制研究的深入，国外学者发现 IL-8 在 COPD 患者血中、痰及 BALF 中 明显升高，且 BALF 中 IL-8 水平明显高于血清 11、13、14、15 。而对于 COPD 老 年患者 BALF 中 IL-8 的研究在国内尚少见报道。为了更好反映我国老年人 COPD 局部气道炎症情况，我们对老年 COPD 患者 BALF 中细胞进行分类比较， 对 IL-8 水平进行了测量，并对他们的相关性进行了分析。 对 象 和 方 法 一、研究对象 实验组选择自 2013 年 10 月2014 年 3 月于我院慢性阻塞性肺疾病患者共 31 例，其中急性加重期组 15 例（男 11 例，女 4 例） ，平均年龄 6113 岁，其 中吸烟者 14 例，不吸烟者 1 例。临床缓解期组 16 例（男 15 例，女 1 例） ，平 均年龄 639 岁，其中吸烟者 11 例，不吸烟者 5 例。均符合我国慢性阻塞性肺 疾病诊治指南（2013 年修订版）诊断标准 16，并符合下列标准：（1）无哮喘 病史，吸入沙丁胺醇 200g 后 FEV1 占预计值可逆性小于 10%。 （2）无合并严 重心、肝、肾等系统疾病。又进一步将实验组（n=31）分为吸烟组（n=25）和 不吸烟组（n=6） 。 对照组 10 例，其中男 6 例，女 4 例，平均年龄 655 岁，经询问病史，均 无呼吸系统疾病史，近 2 月无急、慢性气道炎症疾病史，肺功能测定和影像学 检查均未发现异常。 二、肺功能检测 采用肺功能仪对实验对象行肺功能检查（COPD 患者行支气管扩张试验后 肺功能检查） ，记录 FEV1 数值。受试者行肺功能检查前至少 48 小时未用长效 支气管扩张剂或 8 小时内未用短效支气管扩张剂。 三、标本采集 分别对 COPD 急性加重期、稳定期患者和对照组行支气管肺泡灌洗，一般 取右肺中叶灌洗 17。1、 先通过一细硅胶管在要灌洗的肺段经活检孔注入 2% 利多卡因 12ml，做灌洗肺段局部麻醉；2、 将纤维支气管镜顶端紧密楔入右 肺中叶开口处，再经活检孔通过硅胶管快速注入 37灭菌生理盐水。每次 20ml, 总灌洗量为 60100ml。3、 立即用 70mmHg(1mmHg=0.133kPa)负压吸引回收 灌洗液，回收率为 40%。4、 立即将回收液用双层无菌纱布过滤，记录回收液 总量，装入硅塑瓶，置于装有冰块的保温瓶中，送往实验室。 四、标本处理 将回收灌洗液装入塑料离心管内，在 4下以 1200r/min 离心 10min,将上 清液置于无菌塑胶管中-20储存，留取细胞成份。BALF 有核细胞计数分类： 将 BALF 中有核细胞离心涂片后，行瑞氏染色，在 40 倍光学显微镜下计数 200 个细胞，进行细胞分类计数统计。IL-8 活性测定：采用双抗定量夹心酶联免疫 吸附测定法（Enzyme Linked-Immune-Sorbent Assay, ELISA）检测 BALF 中 IL-8 值，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。 五、统计学处理 本研究采用 SPSS13.0 统计软件进行统计学处理，数据以均数标准差 （ Xs）表示，其中多个样本均数比较采用单因素方差分析（one way ANOVA） ，对两样本资料比较采用成组 t 检验（Independent-Samples T Test） ， P0.05 为有统计学意义。并对实验结果参数间行相关性分析。 结 果 一、患者一般情况 在 COPD 患者中，吸烟者高达 25 例，而从未吸烟者仅为 6 例。此外， COPD 急性加重期患者 FEV1 明显低于 COPD 稳定期患者和对照组 （42.6vs.62.9, P0.05）,( 42.6vs.90.3, P0.05), COPD 稳定期患者 FEV1 低于对 照组（62.9vs.90.3, P0.05 ） 。 （表 1） 表 1 患者一般情况 吸烟史 例数 年龄 有 无 FEV1 (%) （n） （岁） 对照组 10 655 无 10 90.38.3 急性期组 15 6113 14 1 42.619.1 稳定期组 16 639 11 5 62.916 二、COPD 急性加重期、稳定期以及对照组支气管肺泡灌洗液中 IL-8 的含量 1、COPD 急性加重期患者 BALF 中 IL-8 浓度为（ 112367.33 pg/ml）, COPD 稳定期患者 BALF 中 IL-8 浓度为（855197.17 pg/ml）, COPD 急性加 重组明显高于稳定期组（P0.01 ） ，有统计学意义。 （表 2、图 1） 表 2 COPD 急性期与稳定期 BALF 中 IL-8 水平（ Xs） COPD 急性期组 COPD 稳定期组 t P IL-8 112367.33 855197.17 4.995 0.01 (pg/ml) *两组 BALF 中 IL-8 水平比较有统计学意义（P0.01） 0 500 1000 1500 IL-8(pg/ml) 1 图 1 COPD急 性 期 与 稳 定 期 BALF中 IL-8水 平 COPD急 性 期 COPD稳 定 期 2、COPD 急性加重期患者 BALF 中 IL-8 浓度为（ 112367.33 pg/ml）,对 照组 BALF 中 IL-8 浓度为（208.2177.65 pg/ml） 。COPD 急性加重期组明显高 于对照组（P0.01）,有统计学意义。 （表 3、图 2） 表 3 COPD 急性期与对照组 BALF 中 IL-8 水平（ Xs） COPD 急性期组 COPD 对照组 t P IL-8 112367.33 208.2177.65 17.463 0.01 (pg/ml) *两组 BALF 中 IL-8 水平比较有统计学意义（P0.01） 0 500 1000 1500 IL-8(pg/ml) 1 图 2 COPD急 性 期 与 对 照 组 BALF中 IL-8水 平 COPD急 性 期 对 照 组 3、COPD 稳定期患者 BALF 中 IL-8 浓度为（855197.17pg/ml）,对照组 BALF 中 IL-8 浓度为（208.2177.65 pg/ml） 。COPD 稳定期组明显高于对照组 （P0.01）,有统计学意义。 （表 4，图 3） 表 4 COPD 稳定期与对照组 BALF 中 IL-8 水平（ Xs） COPD 稳定期组 对照组 t P IL-8 855197.17 208.2177.65 8.296 0.01 (pg/ml) *两组 BALF 中 IL-8 水平比较有统计学意义（P0.01） 0 500 1000 IL-8 (pg/ml) 1 图 3 COPD稳 定 期 与 对 照 组 BALF中 IL-8水 平 COPD稳 定 期 对 照 组 三、COPD 急性加重期、稳定期以及对照组支气管肺泡灌洗液中 NEU 比率变化 COPD 急性加重组 BALF 中 NEU 比率为（55.4324.31%） ，稳定期组 BALF 中 NEU 比率为（28.9820.43%） ，对照组 BALF 中 NEU 比率为 （2.251.21%） ，COPD 急性加重组明显高于稳定期组和对照组（ P 均0.05） ， 有统计学意义。且 COPD 稳定期组明显高于对照组（ P0.05） ，有统计学意义。 （图 4） 图 4 COPD 急性期组、稳定期组和对照组 BALF 中 NEU 比较 三 组 BALF中 嗜 中 性 粒 细 胞 比 较 0 20 40 60 80 100 急 性 期 稳 定 期 对 照 组 嗜中 性粒 细胞 （%） -40 -20 0 20 40 60 80 100 四、COPD 急性加重期、稳定期以及对照组支气管肺泡灌洗液中 EOS 比率变化 COPD 急性加重组 BALF 中 EOS 比率为（9.308.11%） ，稳定期组 BALF 中 EOS 比率为（2.221.13%） ，对照组 BALF 中 EOS 比率为（0.480.62%） ， COPD 急性加重组明显高于稳定期组和对照组（P 均0.05） ，有统计学意义。且 COPD 稳定期组明显高于对照组（P0.05 ） ，有统计学意义。 （图 5） 图 5 COPD 急性期组、稳定期组和对照组 BALF 中 EOS 比较 三 组 BALF中 嗜 酸 性 粒 细 胞 比 较 -5 0 5 10 15 20 25 30 急 性 期 稳 定 期 对 照 组 嗜酸 性粒 细胞 比率 （% ） 五、BALF 中 IL-8 浓度、NEU 比率、EOS 比率以及 FEV1 的相关性分析 1、BALF 中 IL-8 浓度与 NEU 比率呈正相关（r=0.715, P0.01）(图 6)； BALF 中 IL-8 浓度与 FEV1呈负相关（r= - 0.628,P=0.004） （图 7） ，均有统计 学意义。 图 6 IL-8 与嗜中性粒细胞相关性分析 10.80.60.40.20.0.与与与%与12080.6.40.2IL-(pg/ml)IL-8与与与与R SqLinear =52 图 7 IL-8 与 FEV1 相关性比较 150.120.90.60.30.0. FEV112080.6.40.2IL-(pg/ml)IL-8与FEV1与与R SqLinear =.39 2、FEV 1与 BALF 中 NEU 比率呈负相关（r= -0.573 ,P=0.016）(图 8)，有统计 学意义。 图 8 FEV1 与 NEU 比率相关性 70.6.50.4.30.2.10 与与与%150.2.90.6.30FEVFEV1与与与R SqLinear =.328 3、FEV 1与 BALF 中 EOS 比率呈负相关（r= -0.912,P0.01）(图 9) ，有统 计学意义。 图 9 FEV1 与 EOS 比率相关性 30.25.020.15.010.5.00. 与与与%与80.6.40.2.FEV1FEV1与与与与R SqLinear =82 六、COPD 吸烟组和不吸烟组 BALF 中 IL-8 水平的比较 COPD 吸烟组和不吸烟组 BALF 中 IL-8 水平分别为（1060.16126.55） pg/ml 和（680.33165.52）pg/ml。COPD 吸烟组 BALF 中 IL-8 水平明显高于不 吸烟组（P0.01）。（表 5、图 10） 表 5 COPD 吸烟组与不吸烟组 BALF 中 IL-8 水平（ Xs） COPD 吸烟组 不吸烟组 t P IL-8 1060.16126.55 680.33165.52 6.231 0.01 (pg/ml) *两组 BALF 中 IL-8 水平比较有统计学意义（P0.01） 0 200 400 600 800 1000 1200 IL-8(pg/ml) 1 图 10 COPD吸 烟 组 和 不 吸 烟 组 IL-8水 平 COPD吸 烟 组 COPD不 吸 烟 组 讨 论 COPD 是一种进行性的不完全可逆的气道阻塞为特征的慢性气道炎症性疾病， 气流受限不完全可逆，通常呈进行性发展，并与肺脏对有害颗粒和气体的异常 炎症反应有关。引起 COPD 的危险因素包括个体易感因素以及环境因素两个方面， 两者相互影响。COPD 的诊断应根据临床表现、危险因素接触史、体征及实验室 检查等资料综合分析确定。考虑 COPD 的主要症状为慢性咳嗽、咳痰和（或）呼 吸困难及危险因素接触史；存在不完全可逆性气流受限是诊断 COPD 的必备条件。 肺功能测定指标是诊断 COPD 的金指标。肺功能检查对确定气流受限有重要意义， 是判断气流受限的客观指标，其重复性好，对 COPD 的诊断、严重程度评价、 疾病进展、预后及治疗反应等均有重要意义。气流受限是以第一秒用力呼气容 积（FEV 1）和 FEV1/用力肺活量 (FVC)降低来确定的。BAL 检查是利用纤维支 气管镜向支气管肺泡内注入生理盐水并随即抽吸，收集肺泡表面衬液，检查其 细胞成份和可溶性物质的一种方法。1964 年 Shiigaeo Lkeda 发明了纤维支气管 镜并使用于临床，为 BAL 打下基础，1974 年 Reynolds 与 Newball 等发展了支 气管肺泡灌洗技术。目前 BAL 已广泛应用于临床研究和治疗各方面，在对于有 关疾病的临床诊断以及研究肺部疾病的病因，发病机制，评价疗效和预后上占 有重要地位。 COPD 的发病机制尚未完全明了。目前普遍认为 COPD 以气道、肺实质和 肺血管的慢性炎症为特征，在肺的不同部位有肺泡巨噬细胞、T 淋巴细胞(尤其 是 CD8+)和中性粒细胞增加，部分患者有 EOS 增多。国内外研究发现 BALF、 痰及血清中中性粒细胞，EOS 在 COPD 急性期明显高于稳定期和正常对照，认 为气道炎症在急性期、稳定期始终存在 5、8、13、18、19 。本研究采用瑞氏染色的 方法，在显微镜下对 COPD 急性期、稳定期以及对照组三组 BALF 中炎症细胞 进行分类，发现 COPD 急性期 BALF 中 NEU、EOS 比率明显高于 COPD 稳定 期和对照组，且 COPD 稳定期明显高于对照组，与国内外研究一致。此外， COPD 患者 FEV1 与 NEU 和 EOS 均呈负相关 20。说明 NEU、EOS 参与了 COPD 气道炎症反应，与气道阻塞程度相关 1013。 COPD 急性期 BALF 中 EOS 比率的增高，说明在急性加重期不光存在感染性炎症，还有过敏性炎症的存在， 更有学者提出，无症状性非特异性气道高反应的进展可能将导致 COPD2123。 IL-8 是细胞趋化因子家族中的主要组成成分，又名中性粒细胞活化肽。 IL-8 对中性粒细胞有趋化和激活作用，可使中性粒细胞外形改变，促进其脱颗 粒，激活中性粒细胞并使其产生呼吸爆发（respiratory burst)、释放超氧化物 （O2-、 H2O2）和溶酶体酶，还能诱导中性粒细胞上调 Macl 抗原 （CD11b/CD18)的表达，促进中性粒细胞粘附到内皮细胞和内皮细胞下的基质 蛋白。IL-8 可增加 L-选择素、白细胞黏附分子-1 的表达，促进整合素介导的 中性粒细胞与内皮细胞的黏附，还可通过刺激磷脂酰肌醇-4-激酶途径，导致快 速、持久地中性粒细胞肌动蛋白聚合和微丝等细胞动力装置改变，从而有助于 中性粒细胞跨内膜向肺内浸润，促进中性粒细胞聚集，活化，加重炎症反应 24。 在许多肺部疾病过程中，IL-8 呈升高趋势，且往往与局部浸润的单核细胞和中 性粒细胞数量相平行。有研究证实 BALF 中 IL-8 水平明显高于血清 25，可以认 为 BALF 更能反映 COPD 局部气道炎症。本研究对 COPD 急性期、稳定期和对 照组三组 BALF 中 IL-8 浓度进行检测，相互比较，并把 IL-8 浓度与 NEU、FEV 1 行相关性分析。研究发现，COPD 急性期 BALF 中 IL-8 浓度明显高于稳定期和对 照组（P 均0.05） ，稳定期组 BALF 浓度明显高于对照组（P0.05)。说明 COPD 患者气道炎症持续存在，而当病情急性加重时，活化的炎症细胞增多，IL-8 生 成和释放增多，进一步加重气道炎症，致气道损伤、重构，气流受限加重，肺 功能下降，FEV 1下降，患者缺氧加重，二氧化碳潴留。从实验结果可见，FFEV 1 与 IL-8 以及 NEU 比率呈负相关，而 IL-8 浓度与 NEU 比率呈正相关，恰恰证明 了三者相互影响，加重气道阻塞。也说明了 IL-8 以及 NEU 在 COPD 气道重构中 起重要作用，预示着 COPD 进展过程，对其发病机制的研究可能有指导意义。 吸烟和呼吸道感染是 COPD 发病的两个重要的因素。吸烟可降低巨噬细胞 识别、吞噬能力 26，减少肺泡表面活性物质，使气道防御力下降 27，致气道炎 症进展。吸烟通过激活 NF-b 刺激肺泡上皮细胞释放 IL-8，引起 IL-8 以及 NEU 升高，巨噬细胞聚集，增加蛋白酶活性，致肺组织结构改变，气道阻力增 加 28。本组实验发现，实验组选择的 COPD 患者中，吸烟者所占比例高达 80.6%， 无吸烟史者仅为 19.4%，且 COPD 吸烟组 BALF 中 IL-8 水平明显高于 COPD 不 吸烟组。可以考虑吸烟可能促进炎症介质的致炎作用，在 COPD 发病中起重要 的作用。故有学者提出，戒烟有可能延缓 COPD 疾病进展 29。 在本实验中，由于老年 COPD 患者病情原因，部分实验对象不能配合肺功 能检查，故我们选取了能配合肺功能检查的实验对象的数据进行了相关性分析， 结果能够反映整体趋势变化，对实验结果无显著影响。 综上所述，检测 BALF 中的炎症细胞变化及炎性介质，对于 COPD 局部炎症 变化更具有意义。测定 IL-8、NEU 和 EOS 可能对明确 COPD 发病机制有指导 意义, 且 IL-8 和 NEU 水平可能可以反映 COPD 的发生和发展情况，判断治疗 效果和预后。同时如果能够控制 IL-8 水平以及降低炎症细胞比率,调节免疫反 应，减少炎症反应的负面效应，可能对于治疗 COPD 或减轻其症状有益。 参 考 文 献 1 Peleman RA, Rytila PH, Kips JC, Joos GF, Pauwels RA, The cellular composition of induced sputum in chronic obstructive pulmonary disease. 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