微生物工程实验内容

微 生 物 工 程 实验指导 曾 松 荣、柯 野 编 韶关学院 英东生命科学学院 （适用专业：10 级本科生物技术） 重组毕赤酵母发酵表达蛋白酶及其初步鉴定 一、实验目的 1、学习重组毕赤酵母培养基产物表达的方法。 2、学习发酵过程中菌体浓度的测定。 3、学习表达的重组蛋白酶的鉴定及其酶活的测定。 二、实验内容 1、毕赤酵母的菌体生长和诱导表达的培养基的制备。 2、重组毕赤酵母生长菌体曲线的测定。 3、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达。 4、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达发酵液的酶活测定。 5、SDS-PAGE 鉴定重组蛋白酶。 三、实验原理 蛋白酶是催化蛋白质化合物中肽键水解为小肽或氨基酸的一类酶总称，广泛存在于 动物内脏、植物茎叶、果实及微生物中，并且对生物体的生理调控、催化各种代谢反应 等方面具有重要的作用。蛋白酶是一类重要的工业用酶，约占整个工业用酶量 60%以上； 广泛应用于食品加工、皮革、医药和化工等行业。由于蛋白酶具有广泛的工业、食品和 医药等方面的应用价值，目前工业上需求量大。植物中提取的蛋白酶主要是中性蛋白酶。 植物蛋白酶生产依赖于植物种植，这易受到季节、地理、气候等多因素的影响致使来源 不稳定。动物源性蛋白酶多从牛、羊和猪等的胰脏中提取而得。动物来源蛋白酶生产成 本较高，并受到世界动物保护协会和人员的强烈反对，目前主要用于医药方面。因此， 动植物源蛋白酶不能满足当代工业的需要。微生物源蛋白酶几乎具有所有植物和动物来 源蛋白酶的应用特性，成为了目前的蛋白酶的重要来源。据统计，微生物蛋白酶占据了 世界蛋白酶销售大约 70%以上的份额。 目前商业化的蛋白酶主要来源于芽孢杆菌，中性蛋白酶来自植物木瓜，而来源于真 菌的极少。目前，国内外学者对来源于霉菌的蛋白酶的研究主要集中于通过优化固体(或 者液体)发酵来提高蛋白酶的产量或通过分离纯化其产生的部分酶进行性质研究；而优 化发酵条件很难大幅度提高蛋白酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株生 长状态)影响。并且霉菌产生的蛋白酶种类较多，这增加了蛋白酶的纯化难度，阻碍了 其进一步的开发利用。因此采用基因工程技术，利用霉菌的蛋白酶基因整合到毕赤酵母 的基因组上构建工程菌株，利于高产获得重组霉菌蛋白酶。 毕赤酵母表达系统是目前表达异源蛋白性能较好的系统之一，其操作工艺简单，表 达量高。该表达系统能对表达的蛋白进行折叠和翻译后修饰，获得具有活性的目的蛋白， 该目的蛋白能直接分泌至发酵液中便于分离与纯化。毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白 （SCP） ，有很好的发酵基础，菌体密度可达 100g/L 干重。其生长培养液的组分包括无机 盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基 中快速生长，其中醇氧化酶 AOX-甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的 30%。 而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到 AOX。AOX 的合成是在转 录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调 控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外 的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。 四、器材与试剂 1、菌种：重组蛋白酶毕赤酵母工程菌株，本菌株由本实验室自己构建保藏。 2、培养基 BMGY 培养基：酵母提取物 10.0 g，胰蛋白胨 20.0g，YNB 13.4g，500生物素溶液 （410-5%生物素）2.0 mL，甘油 10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水 900mL。 BMMY 培养基：酵母提取物 10.0 g，胰蛋白胨 20.0g，YNB 13.4g，500生物素溶 液（410-5%生物素）2.0 mL，甲醇 10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水 900mL。 3、试剂 福林试剂(Folin 试剂)：于 2000mL 磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O) 100g，钼酸钠(Na2MoO4.2H2O) 25g，蒸馏水 700mL，85%磷酸 50mL，浓盐酸 100mL， 文火回流 10h。取去冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4) 50g，蒸馏水 50mL，混匀，加入几滴 液体溴，再煮沸 15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有 绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至 1000mL，用细菌漏斗(No4-5) 过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加 2 倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 0.4mol 碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠(Na2CO3) 42.4g，定容至 1000mL。 0.4mol 三氯乙酸(TCA) 溶液：称取三氯乙酸(CCL3COOH) 65.4g，定容至 1000mL。 pH7.2 磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠 (NaH2PO4.2H2O) 31.2g，定容至 1000mL， 即成 0.2mol 溶液(A 液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 71.63g，定容至 1000mL， 即成 0.2mol 溶液(B 液)。取 A 液 28mL 和 B 液 72mL，再用蒸馏水稀释 1 倍，即成 0.1mol pH7.2 的磷酸盐缓冲液。 2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素 2g，称准至 0.002g，加入 0.1N 氢氧化钠 10mL， 在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸 )，然后用 pH 7.2 磷酸盐缓冲液定容至 100 mL 即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。 100g/mL 酪氨酸溶液：精确称取在 105烘箱中烘至恒重的酪氨酸 0.1000g，逐步加 入 6mL 1N 盐酸使溶解，用 0.2N 盐酸定容至 100mL，其浓度为 1000g/mL，再吸取此 液 10mL，以 0.2N 盐酸定容至 100mL，即配成 100g/mL 的酪氨酸溶液。此溶液配成后 也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。 电极缓冲液（pH 8.3）：0.025mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris） ， 0.1% 十二烷基硫 酸钠（SDS）：称 3.02 gTris、14.42 g 甘氨酸，1g SDS ，用蒸馏水定容至 1000ml。 分离胶缓冲液（pH8.8）：1.5 mol/L Tris-HCl 称 18.171 gTris，80 ml 蒸馏水溶解， 用浓 HCl 调 pH 8.8，蒸馏水定容至 100ml。 浓缩胶缓冲液（pH6.8）：0.5 mol/L Tris-HCl 称 6.075 gTris，80ml 蒸馏水溶解，用 浓 HCl 调 pH 6.8，蒸馏水定容至 100ml。 凝胶：30%丙稀酰胺（Acr） 、1.6%甲叉双丙稀酰胺（Bis） 称 30 gAcr、0.8 g Bis ， 加少许蒸馏水热溶, 用蒸馏水定容至 100 ml。 染色液：称 2.5 g 考马斯亮兰 R-250，加 500 ml 甲醇，100 ml 醋酸, 用蒸馏水定容 至 1000 ml。 脱色液：取 250 ml 甲醇，70 ml 醋酸，用蒸馏水定容至 1000ml 样品缓冲液：取 10% SDS 1ml，二巯基乙醇（13.5mol/L）0.6 ml ，甘油 1.5ml，0.05% 溴酚兰少许，0.5mol Tris-HCl(pH6.8)定容至 10 ml。 样品处理：将血清用样品缓冲液稀释至蛋白含量为 1mg/ml，煮沸 5min。 10% SDS：称 10.0 g SDS，用蒸馏水定容至 100 ml。 4、器材 分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、pH 计、离心机、电子天平、电泳槽等。 五、实验操作 （一）配制 BMGY 和 BMMY 培养基 1 称量：按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。 2 溶解：向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。 3.调节 pH 值：用玻璃棒沾少许液体，测量 pH 值。用氢氧化钠和盐酸调节 PH，本 实验采用的是缓冲液配制培养基，也需要培养基的最终 pH。 4.分装及包扎：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗） 或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。 6.灭菌：高压蒸汽灭菌，121 灭菌 20 分钟。 （高压蒸汽灭菌器使用方法：加水 至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。通电加热，同时 打开排气阀门，排净其中冷空气。 待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排 出时） ，关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(一般是 101.53kPa，即 15 磅/英寸 2，温度为 121.3 )，开始计时，维持 15-30min。灭菌时间到达后，停止加热， 待压力降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。切不可在压力尚未降低为零 时突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。 ） 7.灭菌后验证灭菌是否彻底：将培养基放置于 37培养箱中，培养 48 h，检测是否 有菌生长。 （二）重组毕赤酵母生长曲线测定 1、种子液制备 取重组毕赤酵母工程菌株斜面菌株 1 支，以无菌操作挑取 1 环菌苔，接入 BMGY 培养液中，250rpm，30振荡培养 24 h。 2、接种培养 用 5ml 无菌吸管，准确地吸取 5ml 重组毕赤酵母工程菌株的培养液，接种到灭菌装 有 50ml BMGY 培养液的 250ml 的三角瓶中，接种后振荡，使菌体混匀。 3、培养 将接种后三角瓶放置于摇床上，250rpm，30 振荡培养。分别在 0、2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 小时从三角瓶中取出一定体积的菌悬液，立 即放 4冰箱中贮存，最后一起比浊测定光密度值。 4、比浊测定 以未接种的 BMGY 培养液作空白对照，选用 600 nm 波长进行光电比浊测定。从最 稀浓度的菌悬液开始依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的 BMGY 培养基适当 稀释后测定，使其光密度值在 0.1-0.65 以内，记录 OD 值时，注意乘上所稀释的倍数。 （三）重组毕赤酵母的诱导表达 1、取出冰箱中保存的重组毕赤酵母工程菌株，接种于含 25mL BMGY 培养基的 250mL 摇瓶中，28-30振荡培养（ 250300rpm ）至对数生长期 OD600 达 2-6，约 16- 18h） 。 2、室温下以 3000 g 离心 5min 回收酵母细胞。弃去上清，将细胞重悬于适当体 积的 BMMY 培养基中，至 OD600 值为 1.0-2.0（约 100-200mL） 。 3、将培养液置于 1L 摇瓶中，覆盖两层无菌纱布和一层灭过菌的报纸，置摇床中， 2830继续培养并开始诱导表达（注意诱导温度应严格控制，不要超过 30） 。 4、诱导表达起始后，每隔 12h 补加 100%甲醇至终浓度为 0.5%2%以维持诱导。 5、诱导开始后，每隔 24h 取样一次，直至 168h。每次取诱导培养液 1mL 于 1.5mL 离心管中，室温下以最大转速离心 2-3min，将上清液和细胞沉淀分别冻存于-20。 （四）发酵液酶活的测定 1、 标准曲线的绘制 1.1、按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表 1)。 表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 管号试剂 1 2 3 4 5 6 蒸馏水， mL 10 8 6 4 2 0 100g/mL 酪氨酸， mL 0 2 4 6 8 10 酪氨酸最 终浓度， g/ml 0 20 40 60 80 100 1.2、 测定步骤 取 6 支试管编号按表 1 分别吸取不同浓度酪氨酸 1mL，各加入 0.4 mol 碳酸钠 5 mL， 再各加入已稀释的福林试剂 1mL。摇匀置于水浴锅中。40保温发色 20min 在 721 型分 光光度计进行测定(波长 660nm)。一般测三次，取平均值。将 1-6 号管所测得的光密度 (OD)减去 1 号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净 OD 数。以净 OD 值为横坐标， 酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线(或可求出每度 OD 所相当的酪氨酸量 K)。 2、发酵液的稀释液 取一定量的发酵液，加入 pH7.2 磷酸盐缓冲液稀释为 2 倍、4 倍、8 倍和 10 倍的稀 释液。 3、样品测定 取 15100mm 试管 3 支，编号 1、2、3(做 2 只也可) ，每管内加入样品稀释液 1mL， 置于 40水浴中预热 2 min，再各加入经同样预热的酪蛋白 1mL，精确保温 10min，时 间到后，立即再各加入 0.4mol 三氯乙酸 2 mL，以终止反应，继续置于水浴中保温 20min， 使残余蛋白质沉淀后离心 1000rpm、10 min，然后另取 15150mm 试管 3 支，编号 1、2、 3，每管内加入滤液 1mL，再加 0.4mol 碳酸钠 5mL，已稀释的福林试剂 1mL，摇匀，40 保温发色 20min 后进行光密度(OD)测定。 空白试验也取试管 3 支，编号(1)、(2)、(3) ，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先 加 0.4mol 三氯乙酸 2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。 样品的平均光密度(OD)-空白的平均光密度(OD)=净 OD 值。 4、计算 在 40下每分钟水解酪蛋白产生 1g 酪氨酸，定义为 1 个蛋白酶活力单位。 发酵液的蛋白酶活力单位= 式中： A-由样品测得 OD 值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或 OD 值K)； 4-4 毫升反应液取出 1 mL 测定 (即 4 倍) ；N-酶液稀释的倍数；10-反应 10min。 （五）SDS-PAGE 鉴定重组蛋白酶 1、安装垂直平板电泳槽。 2、灌制分离胶 在 100ml 烧杯中依次加入重蒸水 3.35ml，1.5mol/LT ris-HCl (pH8.8)缓冲液 2.5ml ，10%SDS 0.1 ml，凝胶贮备液 4.0 ml， 10%过硫酸铵 50l 和 TEMED 5l，由于加入 TEMED 后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻 璃之间灌注，留出梳齿的齿高加 1cm 的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆 盖一层异丙醇，将电泳槽垂直静置于室温下约 30min，待分离胶聚合完全后，除去覆盖 的异丙醇，尽可能去干净。 3、制备浓缩胶 一般采用 5%的浓缩胶，配制方法：重蒸水 3.4 ml，0.5mol/l Tris-HCl 缓冲液（pH6.8） 0.63 ml、10% SDS 50ul、凝胶贮备液（Acr/Bis ）0.83 ml，10 %过硫酸铵 50l、TEMED 5l， 在 100ml 烧杯中混匀，灌注在分离胶