牛骨成分的综合表征分析

第12卷第6期2017年3月中国科技论文CHINA SCIENCEPAPERVol. 12 No. 6Mar. 2017牛骨成分的综合表征分析阮孝慈，张贵芳，邓宇(天津科技大学化工与材料学院，天津300457)摘要：对牛骨骨粉内部构造进行傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)、X射线衍射（X-raydif- fraction，XRD)、能谱仪（energy disperse spectroscopy，EDS)、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC)、热重分析 (thermal gravity analysis，TGA)检测分析牛骨成分、晶型、所含元素等性质。结果显示，牛骨骨粉中羟基磷灰石的钙、磷原子分 数比值为1. 53,其晶型与标准卡片（CPDS 09-0432)符合较好，牛骨胶原为I型胶原，热收缩温度在90 C左右，牛骨骨粉所含易 挥发物质及有机物质总量约为50.39%，牛骨骨粉中胶原蛋白与羟基磷灰石之间存在较强的氢键作用。通过对牛骨骨粉成分进 行仪器分析，不仅可以为畜骨提供基础实验数据，还可以为从牛骨骨粉中提取天然羟基磷灰石实验奠定基础。关键词：家畜生物化学；成分分析；牛骨；仪器分析；畜骨表征中图分类号：Q501文献标志码：A文章编号=2095-2783(2017)06-0712-04The comprehensive characterization of bovine bone tissueRUAN Xiaoci, ZHANG Guifang, DENG Yu(.Collage of Chemical Engineering and Materials Science , Tianjin University ofScience & Technology , Tianjin 300457，China)Abstract: The methods of Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR)，X-ray diffraction (XRD)，differential scanning calorimetry (DSC)，energy dispersive spectrometer (EDS) andthermogravimetricanalysis (TGA)havebeenusedto analyzethechemical component，crystalline andchemical elementsof the bovinebone.The Ca/P ofhydroxyapatiteinbovineboneis1. 53and thecrystallineiscompliant withthe standard(JCPDS09-0432).Theshrinkagetemperatureofcollagen typeIinbovine boneis 90 C，whichshigherthan standardcollagentype I. Thetotalpercentage compositionofvolatiles andorganicmatter is 50.39%. Theanalysis ofbovinebonenotonly cansupplement thelaboratory databut also provides the foundation for theabstractionof hydroxyapatite from bovine bone.Keywords: animalbiochemistry；composition analysis；bovinebone；instrumentalanalysis；characterizationoflivestockbone收稿日期： 2016-09-20基金项目：国家自然科学基金资助项目（21476175)第一作者：阮孝慈（1991一），女，硕士研究生，主要研究方向为天然物提取与分离 通信作者：邓宇，教授，主要研究方向为精细有机合成及绿色化工，dengyutut edu. cn畜骨资源广泛，具有较高的营养价值，其富含骨 胶原、氨基酸、矿质元素等人体所必须的营养成分。 其中，牛骨资源应用广泛，牛骨的综合利用研究曰益 深入并不断扩展。骨产品可分为2类：骨骼提取物 产品和全骨利用产品。骨泥营养丰富，含有有机钙等成分，可制成肉 松、骨味素等食品直接食用，也可作为配料等加入其 他食品中。牛骨汤的加工技术曰益完善1，鲜骨提 取物制成骨素或骨汁粉可作为调味料。骨骼提取物包括骨油、水解明胶、骨胶、羟基磷 灰石等2。通过水煮法、蒸汽法或抽提法可以提取 骨油，骨油可用于制作肥皂、润滑剂、油膏、复写纸、 蜡纸等；脱脂后的畜骨经水煮法可制得骨胶，骨胶是 多种产品的粘合剂，是医药、食品等行业的重要原 料；除去骨胶的畜骨可加工制成骨粉，骨粉可作为有 机肥料改善土壤、促进农作物生长，可作为禽畜饲料 添加剂促进禽畜生长、预防软骨病等；利用蛋白酶可制备水解明胶、抗氧化肽，水解明胶水溶性较好，易 于被人体吸收，可用于高血压、骨质疏松、胃溃疡等 疾病的治疗；此外，骨羟基磷灰石应用于骨修复材 料3、牙齿修复材料4、成骨细胞培养56等的研究不 断深入。分析仪器广泛应用于各行各业，不断推动科学 研究和技术的进展，但对牛骨进行仪器分析却鲜有 报道，因此，对牛肋骨骨粉进行仪器分析以补充基础 数据。本文对牛骨进行常见的仪器分析，包括傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)、 射线衍射（X-ray diffraction, XRD)、 差示扫描量热法（differential scanning calorimetry， DSC)、能谱仪（energy disperse spectroscopy, EDS) 和热重分析（thermal gravity analysis，TGA)，希望 能够为研究者提供参考。第6期阮孝慈，等：牛骨成分的综合表征分析7131材料与方法 1.1实验材料采购新鲜牛肋骨，并用清水清洗，除去残肉、脂 肪和结缔组织等，牛骨晾干砸成小块去除骨髓后粉 碎机粉碎，备用。1.2实验仪器WQF-510型傅里叶变换红外光谱，北京第二光 学仪器厂；了&3500型X射线衍射仪，丹东通达仪器 有限公司；DSC7差示扫描量热仪，美国Perkin-Elmer 公司 ;布鲁克X射线能谱仪EDS QUANTAX， 德国布鲁克公司；TGA Q500热失重测试，美国TA 公司。1.3牛骨骨粉表征FTIR分析：采用压片法对牛骨骨粉进行红外光 谱分析，取适量牛骨骨粉与KBr共同压片，光谱仪扫描次数为16次，扫描范围为44 000 cm-1。XRD分析：样品于60 C下干燥10 h，光源为 Cu-Ka，扫描范围为580，扫描速率为2/min，工 作电流为25 mA。DSC分析：称取56mg牛骨骨粉置于DSC铝 坩埚中，铝坩埚加盖密封，以空铝坩埚为参比。由 20 C升温至200 C，升温速率为5 C/min，样品室氮 气流量为20 mL/min。EDS分析：取适量牛骨骨粉真空干燥，喷镀导电 层，观察样品的微观结构，测定微区主要元素的质量 百分比，重复3次取平均值。能谱仪技术指标：电压 10 kv、束流0. 06 mA、工作距离 10. 0 mm。TG分析：氧气氛围下，由室温升至1 200 C，升 温速率为20 C/min，每次实验称取试样约为10mg， 升温速率为10 C/min,气体流量为60 mL/min。2结果与讨论2.1 FTIR 分析由图1分析可知，3 291 cm1处的吸收峰为吸附 水及0 H伸缩振动产生的吸收峰，此处的吸收峰 为酰胺A带，是N H的伸缩振动峰，同时说明氢键 的存在。自由的NH伸缩振动吸收峰通常位于 3 4003 440 cm-1附近，当其存在于肽键结构中并 且有氢键存在时，N_H伸缩振动峰向低频移动，出 现在3 300 cm-1 左右7。2 924 cm1 和2 853 cm-1 是一 CH2的伸缩振动吸收峰，属酰胺B带特征吸收 峰。1 666 cm-1处的吸收峰属酰胺I带吸收峰。酰 胺I带的吸收峰是在1 6001 700 cm1范围内的强 吸收峰，是多肽主链上C )0伸缩振动的吸收峰。 般情况下，酰胺n带的吸收峰位于1 5501560 cm 1之间，是N H弯曲振动和C一N伸缩振动引 起的吸收峰。由图1可知，酰胺n带的吸收峰位于 1 544 cm1处，向低频移动，主要是因为牛骨胶原三 股螺旋结构中氢键结构的存在。1 464、1417 cm-1 为一CH3和一CH2的弯曲振动峰，同时为C03进 入羟基磷灰石晶格取代P04-出现的分裂峰。1239 cm-1处的吸收峰归属于酰胺1带，是C+N伸缩振动 和N+H弯曲振动，以及甘氨酸主链脯氨酸侧链 上一CH2的非平面摇摆振动的特征吸收峰，1 030 cm-1为P04的对称伸缩振动，871 cm-1处为C02- 进入羟基磷灰石晶格取代P03-的特征吸收峰，该峰 为AB型取代的特征吸收峰； 604 cm-1和561 cm-1 为牛骨中羟基磷灰石中P04的弯曲振动。1 746、 1 161、099、722 cm-1为牛骨骨粉中骨油峰吸收 峰其中1 746 cm-1为酯类C )0伸缩振动峰， 1 161 cm-1和1 099 cm-1为C 0C的伸缩振动吸 收峰,722 cm-1为一（CH2)吸收峰。2.2 XRD分析天然I型胶原的XRD图上主要有3个衍射峰： 2d为78(约1. 3 nm)处为晶区产生的衍射峰， 这种布拉格间距代表的是组成胶原纤维的分子链 间的横向距离；d为2022附近有1个宽的弥散 峰，由胶原纤维内部众多结构层次引起的漫散射产 生，代表I型胶原的无定型分散；20=31(约0. 29 nm)附近有1个小而宽的峰，反映的是胶原螺旋的 1个旋转高度内所对应的轴向周期，即典型的三股 螺旋结构9-11，是判断I型胶原构象完整性的重要 依据12。牛骨骨粉XRD衍射吸收峰与羟基磷灰石标准 卡片（JCPDS 09-0432)对比，结果见表1。牛骨骨粉 中含有与羟基磷灰石相同晶型的成分。中国科技论文第12卷表1牛骨骨粉XRD数据样品d面间距/10-10m衍射峰（hkl)2d 1(3.44(002)25.92.81(211)318标准卡2.78(112)3222.72(300)3292.28(310)4003.42(002)26.0牛骨骨粉278(112)322272(300)329227(310)400牛骨中包含I型胶原和羟基磷灰石，I型胶原在 2d为7. 5左右的衍射峰消失，这说明羟基磷灰石与I 型胶原产生了相互作用，从而影响胶原的结晶结构， 原因可能是羟基磷灰石分子对与胶原形成了氢键。 2.3 DSC分析天然状态下，牛骨胶原蛋白由三条多肽链螺旋 缠绕而成的三股螺旋结构，是较刚硬的棒状分子。 受热时，其天然螺旋结构会在1个较窄的温度空间 内解螺旋，形成3条肽链，呈卷曲无序状态。该温度 空间为胶原的热变性温度，胶原分子从延展的纤维 状态转变为无规则卷曲状态时的温度为胶原的热收 缩温度。因此，在利用DSC进行检测时可以得到牛 骨胶原的热变性温度范围和热收缩温度13。_定温度范围内，羟基磷灰石分子的物理性质 或化学性质不会随温度的变化而发生变化，因此在 利用DSC进行检测时不会出现明显的吸热或放 热峰。牛骨可以看作是由牛骨胶原蛋白和羟基磷灰石 构成的1种高分子材料，故可利用DSC对天然牛骨 进行检测。I型胶原蛋白的热变性范围为4080 C，热收缩温度在70 C左右13。由图3可得，牛骨 在60140 C范围内可出现明显的吸热峰，牛骨胶 原的热收缩温度出现在90 C左右。与I型胶原蛋白 相比，牛骨中胶原蛋白的变性范围增大，热收缩温度 升高，其原因主要为牛骨中羟基磷灰石与胶原蛋白 形成氢键，结合力增大，牛骨结晶度较高。2.4 EDS分析EDS多与SEM组合应用，是应用最为广泛的显微分析仪器，是微区成分分析的主要手段之_。分析牛骨SEM照片（图4)可得，牛骨表面呈粗 糙沟壑状，该粗糙断裂面为牛骨粉碎时造成，牛骨表 层有孔隙，孔径在1 pm左右，骨质紧密。图4牛骨原骨粉SEM照片用EDS分析仪检测SEM扫描微区得出的分析 谱图图5，同时计算机由谱峰强度自动换算为所测主 要元素的相对含量，如表2所示。数据显示，牛骨中 的主要元素为C、N、0、Ca、P，Ca、P元素主要为牛骨 中羟基磷灰石所含元素，C、N元素为牛骨胶原蛋白 所含元素，根据原子计数百分比可得钙、磷原子数分 数比值为1.53,接近羟基磷灰石钙、磷原子数分数比 值 1. 6 7。图5牛骨骨粉EDS图表2 牛骨骨粉各元素分析表元素质量分数/%原子数分数/%C22. 1731 16N12 4414 98039 9442 10P8 574 66Ca16 887 102.5 TGA分析由图6可得，将失重曲线（绿色）分为4个阶段：f200 C ,200 Cf500 C ,500 Cf1 000 C， 1 000 C1 200 C。第1阶段G200 C):主要是由易挥发物质的 蒸发所致，该部分主要为牛骨中所含水分。第2阶段（200 C f500 C )此阶段失重明 显，失重速率达到最大值。当温度达到200 C后有 机物质逐渐分解，C_H、C一 0、C一 C键发生断裂， 牛骨胶原蛋白分子分子链发生断裂，该阶段主要分 解产物为H20、C0、C02以及一些简单的烷烃类化 合物。温度在300 C之前失重斜率较缓，3450 C间斜率最大、失重最快，450 C之后失重斜率趋于第6期阮孝慈，等：牛骨成分的综合表征分析71580%/stK图6牛骨骨粉TG图平缓，说明该阶段不是单一物质的分解或反应，而是 多种物质的分解或多重反应的结合。第3阶段（500 Ci10 C):此阶段质量损 失减缓，说明有机物质的分解作用减弱，失重原因可 能为胶原蛋白分解产生的中间产物逐渐分解。由于 该阶段温度逐渐升高，有机物质可能发生碳化作用， 也是导致失重的原因之_。第4阶段（1 000 Cf1 200 C):此阶段剩余 物质质量趋于衡重，说明有机物已分解完全，但未达 到无机物质的分解温度。原牛骨骨粉总体失重率达到50. 39%，即所含水 分、易挥发物质、有机物质总量约为50.39%。3结论对牛骨进行综合分析可知，FTIR可以检测到牛 骨中含有与I型胶原蛋白、羟基磷灰石、骨油相同的 基团；XRD谱图可以检测到牛骨骨粉中含有I型胶 原XRD衍射吸收峰与羟基磷灰石XRD衍射吸收 峰，羟基磷灰石XRD衍射吸收峰与标准羟基磷灰石 XRD卡片相符，牛骨骨粉中钙磷原子数分数比为 1. 53;牛骨的I型胶原热收缩温度在90 C左右，牛骨 中羟基磷灰石与I型胶原之间存在氢键；牛骨中所含 水分、易挥发物质、有机物质总量约为50. 39%。对 牛骨骨粉成分进行仪器分析，可以为畜骨研究提供 基础实验数据。参考文献(References)1郭耀华，窦春雷，岳兰昕，等.新型牛骨汤工艺技术研 究J.食品研究与开发，2016, 37(1)： 81-84.GUO Yaohua， DOU Chunlei， YUE Lanxin， et al. Study on the new technic of bovine bone soupJ. Food Research and Development， 2016，37 (1): 81-84. (in Chinese)杨红，肖厚荣，张慧，等.高温蒸煮法制备牛骨粉的工 艺研究J.安庆师范学院学报（自然科学版），2015,21(2) : 85-88.YANG Hong，XIAO Hourong，ZHANG Hui，et al. Studies on the technology for the preparation of cattle bone powder by high-temperature cooking J. Journal of Anqing Teachers College (Natural Science Edition)， 2015, 21(2): 85-88. (in Chinese)3何越，田智泉，王亮，等.天然煅烧骨修复材料（骼瑞） 修复动物骨缺损的有效性研究J.实用口腔医学杂 志，2015, 31(2): 167-170.HE Yue，TIAN Zhiquan，WANG Liang，et al. The efficacy of calcined natural bovine bone (CBB) in the treatment of bone defects in animalJ. Journal of Practical Stomatology，2015，31(2): 167-170. (inChinese) 徐燕，翟晓梅，陆玉平，等.复合牛骨在修复牙槽突裂 中的应用J.中国美容医学，2015, 24(8): 27-29.XU Yan， ZHAI Xiaomei，LU Yuping， et al. Reconstruction of unilateral alveolar cleft with bovine bone complex graft J. Chinese Journal of Aesthetic Medi- cine，2015，24(8): 27-29. (inChinese)刘俊丽，郭燕川，宋淑军，等.牛骨胶原蛋白肽促进人 成骨细胞增殖J.明胶科学与技术，2013, 33 (2): 59-62.LIU Junli，GUO Yanchuan，Song Shujun, et al. Bovine bone collagen protein peptide promote proliferation of human osteoblast J. The Science and Technology of Gelatin，2013，33(2): 59-62. (in Chinese)刘俊丽，张兵，宋淑军，等.牛骨胶原肽对成骨细胞分 化的影响J.中国骨质疏松杂志，2014，20(7): 723-727LIU Junli，ZHANG Bing，SONG Shujun，et al. Effect of bovine collagen peptides on the differentiation of os teoblastsJ. China Journal of Osteoporosis， 2014，20 (7) : 723-727. (in Chinese)7 ZHANG Qiang，WANG Qianqian，LU Shun，et al. Comparison of collagen and gelatin extracted from the skins of nile tilapia (oreochromis niloticus) and channel catfish ( ictalurus punctatus) J. Food Bioscience， 2016, 13: 41-48.8 王岩，秦向铭.红外光谱法识别动物油脂及人体脂肪.中国刑警学院学报，2013, 4: 59-60.WANG Yan， QIN Xiangming. Distinguish animal fat and body fat by FT-IRJ. Journal of National Pol