抗缺氧物质灌胃的小鼠的抗缺氧能力测定和hsp70的表达

抗缺氧物质灌胃的小鼠的抗缺氧能力测定和 Hsp70 的表达 青海大学附属医院(810001) 王晓临 河南师范大学科技部重点实验室(453000) 徐存栓 四川大学华西医院肿瘤研究所教育部重点实验室(610041)王修杰 广州美晨药业卫生部重点实验室(510075) 王冬杰 中国科学院西北高原生物研究所(820001) 张宝琛 摘要： 目的：研究抗缺氧物质对小鼠的抗缺氧能力的影响，及 Hsp70的表达。方法：小鼠 100只， 随机分为塞隆肌肉（高原鼢鼠）组、高海拔牦牛肉组、石榴籽组、红景天组和空白对照组， 连续灌胃(ig) l 0天，于常压下进行抗缺氧实验和 Western Blot测定 Hsp70的表达。结 果：红景天组、石榴籽组、塞隆肉组小鼠密闭缺氧存活时间延长；塞隆肉组、石榴籽组、 红景天组灌胃的小鼠的 Hsp70表达被诱导出现。结论：抗缺氧物质(即红景天胶囊、石榴籽 超临界萃取物、 塞隆肉超临界萃取物) 灌胃的小鼠密闭缺氧存活时间均延长；抗缺氧物质 灌胃的小鼠的 Hsp70的表达增强，说明抗缺氧药物可诱导 Hsp70的表达，Hsp 可以作为一 种抗缺氧药物的研究和测试指标。 关健词： 抗缺氧物质灌胃 抗缺氧能力测定 Hsp70 热休克反应 中图分类号: R282.71R364.4 热休克反应是原核细胞还是真核细胞在所处环境的突然发生变化时表 现出特殊的适应性的改变，如细胞代谢及基因表达的改变等，Welch et al1 经果蝇的幼虫在 37.5孵化 20min后发现了一些与热反应有关的蛋白，他们认 为这些蛋白与热有关，故将之称为热休克蛋白（Heat shock protein,Hsp）,这 种反应 称之为热休克反应。理化和生物学因素可引起热休克反应如：炎症、辐射、发 热、病毒感染、缺氧、缺血再灌注、重金属离子、乙醇等多种有害刺激均可诱 导原核和真核细胞合成这类蛋白质,Hsp 是一类高度保守蛋白 2，又被称作 “分子伴侣” 3， Hsp分为若干个家族 4,5，Hsp 对于细胞在生长发育以及 在各种病理生理条件下完整性的维持和功能的发挥都有着不可缺少的作用。药 物刺激可引起的 Hsp70的表达 6,7,8,9。Hsp 在对抗缺氧、自由基损伤、缺血 再灌注等因素引起的细胞氧化应激损伤中有着积极的保护 10。本文通过对抗 缺氧物质灌胃的小鼠耐常压缺氧实验和 Western Blot测定 Hsp70的表达，验证 了抗缺氧药物刺激可以诱导 Hsp70表达出现，探索出 Hsp可以作为一个指标 （即药物是否具有抗缺氧作用） 。 材料和方法 1 试剂 主要化学药品及试剂:丙烯酰胺（acrylamide,Sigma 公司） 、双丙烯酰胺 （bidsarylamide,Fluka 公司） 、， ， ， ， 四甲基乙二胺 （TEMED，Bio-Red 公司） 、明胶（gelatin,Sigma 公司） 、曲拉通 X- 100（TtitonX-100,Bebco 公司） 、十二烷基磺酸钠（SDS，Serva 公司） 、三羟甲 基氨基甲烷（Tris-base,上海巴期生物公司） 、标准分子量蛋白（Serva 公司） 、 考马斯亮蓝 R-250（Coomasie Brillant boue R250,Fluka公司进口分装） 、雪 山奶粉（青海省果洛洲奶粉厂） 、鼠抗人 Hsc70/Hsp70单抗隆抗体 （StressGen,SPA-820,能与人、灵长目动物、啮齿动物和牛 Hsc70/Hsp70的 N 端 180按基酸残基区域特异结合） 、碱性磷酸酶标记羊抗鼠 lgL（北京中山公 司） 、氯化硝基四氮唑蓝（NBT，Sigma 公司） 、吲哆基-磷酸二钠盐（BCIP，B.M 公司） 、硝酸纤维素膜（Gibco 公司） 、吐温 20（Tween20，Sigma 公司） 、牛血 清白蛋白（BSA，华美生的工程公司） 、二氨基联苯胺（DAB，北京中山公司） 、 二乙基焦碳酸酯（DEPC，Sigma 公司） 。本实验所用的其他化学试剂均为分析纯。 塞隆肌肉（高原鼢鼠-Myospalax baileyi）的超临界萃取由广州美晨药业完成， 高海拔牦牛肉及石榴籽的超临界萃取由甘肃省轻工研究所完成。 2动物分组及处理 购入体重 1 8g-22g昆明种小鼠(青海地方病研究所)100 只，雌雄各半， 饲 养 3天后,随机分为塞隆肌肉（高原鼢鼠）组、高海拔牦牛肉组、石榴籽组、阳 性药物对照组和空白对照组，每组 20只 , 正常进食饮水。将海拔 5000m牦牛 肉、塞隆肌肉、石榴籽的超临界萃取物以 l 0浓度连续灌胃(ig)；阳性药物 对 照为红景天组，以青海三普药业红景天胶囊(批号:青卫药准字 1999第 000373 号)配制成 10溶液灌胃；空白对照组则给予等量的蒸馏水灌胃。每只小鼠每 天 灌胃剂量为 002mlg 体重，灌胃时间为 l 0天，每天一次，实验前禁食 12 小时，最后一次给药 l小时后开始实验。共 100只小鼠用于常压下进行抗缺氧 实 验。 3抗缺氧物质的灌胃小鼠耐常压缺氧实验： 1密闭缺氧存活时间的测定 参照保健食品管理法规汇编(1998) 11的方法，最后一次灌胃后 1小 时， 将各组小鼠分别放入盛有 5g钠石灰的 250ml广口瓶内(每瓶内只放 1只小鼠)， 用凡士林涂抹瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，直至呼吸停止。以小鼠在 密 闭广口瓶内存活时间为指标，比较各组小鼠耐缺氧的时间。 2 Western Blot 测定 Western Blot印迹（WB）按 Towbin方法 12进行,取材为缺氧实验后的心肌。 立即置 4缓冲液中匀浆, 12000g离心 10min,取上清液, 测定匀浆液的蛋白质 浓 度, 分光光度计测量出蛋白质浓度和上样的总蛋白量，计算出上样体积后进行 聚丙烯酰胺凝胶电泳,再行 Western Blot。 结果 1抗缺氧物质灌胃的小鼠密闭缺氧存活时间(见表 1) 表 1对小鼠密闭缺氧存活时间的影响（XS） 组别 动物只数 剂量 存活时间（m） 空白组 20 0 02mlg 28.372.15 牦牛肉组 20 0 02mlg 30.381.97 红景天组 20 0 02mlg 38.03.1 石榴籽组 20 0 02mlg 37.52.8 塞隆肉组 20 0 02mlg 38.81.3 注：与空白组 P0.05；与牦牛肉组比较 P0.05,灌胃红景天组， 石榴籽组， 塞隆肉组小鼠密闭缺氧存活时间长。 2. 抗缺氧物质灌胃的小鼠的 Hsp70反应(见图 1, 图 2) 图 1 1组 2 组 3 组 4 组 5 组 注: 图 1塞隆肉组(1 组),石榴籽组, 红景天组(3 组) Hsp70表达被诱导出现, 牦牛肉组(4 组)及空白组(5 组) Hsp70 表达没有出现。 灌胃的小鼠的 Hsp70表达被诱导出现, 说明药物可以诱导 Hsp70的表达。 0 2 4 8 12 15 18 24 26 28 30 32 图 2： -Actin(进样量 50ug) 注：图 2可见，样品的进样量为 50ug时效果较好。经过进样量筛选后，确定了检测小鼠心 肌中 Hsp的表达时进样量为 50ug。 讨论： 抗缺氧物质(即红景天胶囊，石榴籽超临界萃取物， 塞隆肉超临界萃取 物) 灌喂的小鼠密闭缺氧存活时间均延长, 抗缺氧物质的抗缺氧机理是: 红景天的有效活性物质主要为红景天甙,即红景天提取物，红景天提取物 动物常压耐缺氧能力有显著提高,抗缺氧能力的提高，主要是由于机体的细胞功 能对缺氧环境的适应性改变,细胞氧的储备能力和对氧的利用能力增强,机体耐 力和有氧能力随之提高,当出现供氧不足时，肌细胞的有氧能力降低，糖酵解得 到动员，导致乳酸积累而产生疲劳。红景天能提高缺氧耐力和有氧能力，加速 乳酸代谢，降低心肌耗氧量，改善心力储备 13,17 石榴籽超临界萃取物可显著提高小鼠抗缺氧的时间,提示其可改善机体的缺 氧。石榴籽可显著改善脑微循环血流量 18 ，作为天然植物，石榴籽资源丰富， 但其改善微循环和抗缺氧的有效成份及机理需进一步研究和探讨。 塞隆（高原鼢鼠）-对缺氧环境具有很强的适应性 19，研究发现，塞隆 血液当中红细胞数和血红蛋白都具有极显著差异 20；塞隆心肌肌红蛋白含量 为 74167nmolg，骨骼肌肌红蛋白量为 62727nmo1g 都明显高于其它高 原动物 21；塞隆心肌、骨骼肌、肝脏和肾脏中乳酸脱氢酶活性明显低于其它 高原动物 22，说明塞隆在缺氧环境中通过代谢机制的调整，合成和积累了一 些特殊的抗缺氧物质,如共轭亚油酸是其中之一。 服用抗缺氧物质的小鼠的 Hsp70的热休克反应证明，服用抗缺氧物质的小 鼠的 Hsp70的表达增强，测定出其抗缺氧的能力也增强，Hsp 平时表达水平低， 遇应激时迅速升高，Hsp 可被药物所诱导（受转录和翻译两个水平调控） ，药物 可以提高 Hsp表达，Hsp70 的表达量与药物的刺激有关联，Hsp 可以作为一个 抗 缺氧药物的研究和测试指标。 参考文献 1Welch WJMammalian guess response：ceil physiology，structurefunction of stress proteins，and implications for medicine end diseasePhysiol Rev，1992，72：1063-1081. 2Leinonen M, Saikku P. 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