掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化

中国组织工程研究 第 18 卷 第 3 期 20140115 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 15, 2014 Vol.18, No.3 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 365 www.CRTER.org 彭红，女，1987 年生，湖 北省天门市人，汉族， 2013 年四川大学 毕业，硕 士，主要从事生物材料研 究。 通讯作者：余喜讯，副教授， 四川大学高分子科学与工 程学院，四川省成都市 610065 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.03.006 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)03-00365-06 稿件接受：2013-10-24 Peng Hong, Master, School of Polymer Science and Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China Corresponding author: Yu Xi- xun, Associate professor, School of Polymer Science and Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China Accepted: 2013-10-24 掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化 彭 红，顾志鹏，黄程程，徐源廷，余喜讯(四川大学高分子科学与工程学院，四川省成都市 610065) 文章亮点： 1 前期实验发现掺锶聚磷酸钙材料对于单独培养的内皮细胞和成骨细胞的行为有显著促进作用。文章的创新 在于首次从分子水平探讨掺锶聚磷酸钙对共培养下成骨细胞与脐静脉内皮细胞行为和功能蛋白表达的影响。 2 文章的特点在于首次发现成骨肉瘤细胞与内皮细胞共培养于掺锶聚磷酸钙后，掺锶聚磷酸钙上调了细胞血 管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白水平的表达。今后将对血管初期成型方面进行进一步研究， 使体系更完善。 关键词： 生物材料；骨生物材料；掺锶聚磷酸钙；内皮细胞与成骨细胞共培养体系；血管内皮生长因子；碱性成纤维 细胞生长因子 主题词： 生物相容性材料；磷酸钙类；锶；内皮细胞；成骨细胞 摘要 背景：前期实验发现掺锶的聚磷酸钙材料对单独培养内皮细胞或成骨细胞的行为有显著促进作用。 目的：观察掺锶聚磷酸钙对共培养下成骨细胞与脐静脉内皮细胞行为和功能蛋白表达的影响。 方法：取第 3 代人脐静脉内皮细胞与人成骨肉瘤细胞 MG63 以 21 的浓度比接种于 24 孔板中，然后再分 别加入掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙与羟基磷灰石，共培养 7 d 后。采用 ELISA 法检测细胞血管内皮生长因子、 碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达，采用 MTT 法检测细胞活性。 结果与结论：与聚磷酸钙与羟基磷灰石相比，在掺锶聚磷酸钙表面生长的细胞呈现更加良好的形态，细胞融 合生长形成单层覆盖在材料表面，并且在材料表面有一定的跨度生长，说明掺锶聚磷酸钙材料能促进内皮细 胞在其上黏附、伸展，有利于细胞的生长和增殖。掺锶聚磷酸钙组细胞分泌的血管内皮生长因子、碱性成纤 维细胞生长因子明显高于聚磷酸钙组和羟基磷灰石组(P 0.05)，说明掺锶聚磷酸钙可上调血管内皮生长因 子、碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。 彭红，顾志鹏，黄程程，徐源廷，余喜讯 . 掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变 化 J.中国组织工程研究， 2014， 18(3):365-370. Effects of strontium-doped calcium polyphosphate on behavior and angiogenic growth factors expression of co-cultured osteoblasts and endothelial cells Peng Hong, Gu Zhi-peng, Huang Cheng-cheng, Xu Yuan-ting, Yu Xi-xun (School of Polymer Science and Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China) Abstract BACKGROUND: Our previous studies have shown that strontium-doped calcium polyphosphate containing low- dose strontium appears to have a significant effect on angiogenesis-related behaviors of monocultured umbilical vein endothelial cells and osteoblasts. OBJECTIVE: To investigate the effect of strontium-doped calcium polyphosphate on angiogenesis-related behaviors of umbilical vein endothelial cells and osteoblasts co-cultured, including cell adhesion, spreading, proliferation, as well as the protein secretion of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor from co-culture system in vitro. METHODS: Human umbilical vein endothelial cells and osteoblastic cells (MG63) were utilized in this study. Cells from passage 3 were used for preparation of the cell-scaffold constructs. After placed in 24-well plate at a ratio of 2:1, human umbilical vein endothelial cells and MG63 cells were seeded onto strontium-doped calcium polyphosphate, calcium polyphosphate and hydroxyapatite scaffolds and co-cultured for 7 days. The vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor protein levels were determined through a double ligand enzyme-linked immunosorbent assay. The colorimetric 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5- diphenyltetrazolium bromide assay was performed to quantify the effect of scaffolds on cell proliferation. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with those on calcium polyphosphate and hydroxyapatite scaffolds, cells on strontium-doped calcium polyphosphate scaffolds attached and spread better with a significantly improved cell proliferation. More importantly, the vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor expressions were significantly higher in the strontium-doped calcium polyphosphate group than the other two groups (P 0.05), indicating strontium-doped calcium polyphosphate can up-regulate levels of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor proteins. 彭红，等 . 掺锶聚磷酸钙共培养成骨细胞与内皮细胞：行为和功能蛋白的变化 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org366 www.CRTER.org Subject headings: biocompatible materials; calcium phosphates; strontium; endothelial cells; osteoblasts Peng H, Gu ZP, Huang CC, Xu YT, Yu XX. Effects of strontium-doped calcium polyphosphate on behavior and angiogenic growth factors expression of co-cultured osteoblasts and endothelial cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(3):365-370. 0 引言 Introduction 骨 组 织 工 程 的 目 标 是 用 来 修 复 大 面 积 骨 骼 缺 损 。 骨 修 复 过 程 不 仅 是 新 骨 的 生 长 ， 还 需 要 血 循 环 重 建 ， 这 样 才 能 为 新 生 骨 组 织 中 的 细 胞 提 供 养 分 ， 排 泄 废 物 1-2， 所 以 理 想 的 骨 组 织 工 程 支 架 材 料 应 该 具 有 促 血 管 化 功 能 。 在 早 期 骨 折 愈 合 过 程 中 会 出 现 缺 损 局 部 高 能 代 谢 状 态 ， 此 时 对 血 供 及 能 量 物 质 的 需 求 提 高 3-5， 因 此 在 构 建 组 织 工 程 化 骨 组 织 的 同 时 ， 促 进 小 血 管 的 长 入 及 细 胞 与 材 料 复 合 物 内 血 供 的 重 建 就 成 为 骨 组 织 工 程 由 基 础 向 临 床 应 用 的 关 键 性 环 节 6。 血 管 生 成 主 要 受 到 血 管 化 生 长 因 子 的 影 响 。 在 所 有 己 知 的 血 管 化 生 成 因 子 成 员 中 ， 血 管 内 皮 生 长 因 子 是 促 血 管 生 成 作 用 最 为 特 异 而 确 切 的 因 子 ， 其 在 生 理 和 病 理 性 血 管 生 成 中 都 起 着 核 心 的 调 节 作 用 7。 碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 在 促 血 管 生 成 过 程 中 具 有 多 效 性 特 点 ， 它 是 一 种 内 源 性 多 肽 生 长 因 子 ， 同 时 是 另 一 种 最 有 效 的 促 进 血 管 生 成 因 子 ， 它 通 过 提 高 成 骨 细 胞 的 增 殖 和 促 进 内 皮 细 胞 的 生 长 来 促 进 骨 形 成 和 血 管 化 8。 成 骨 细 胞 和 内 皮 细 胞 在 生 长 良 好 的 状 态 下 都 可 以 表 达 血 管 内 皮 生 长 因 子 、 碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 。 然而，在新骨生长过程中诱导快速血管化的困难性成 为骨组织工程应用于坏损组织更换的主要限制因素 9-10。 Pacicca等 11研究发现成骨细胞与内皮细胞共培养，成骨 细胞分泌的血管内皮生长因子量显著高于单一细胞组，同 时有血管样结构形成。Hofmann等 12-13发现成骨细胞与内 皮细胞共培养于支架材料上能够生成血管样结构。共培养 的成骨和内皮细胞之间通过复杂的相互作用控制着骨形成 和血管化 14，将两种细胞在支架材料上共培养是解决骨组 织工程促血管化的一种有效途径。另一方面，支架材料在 骨组织工程的血管化方面也起着重要作用。如果生物材料 或组织工程支架材料自身具有诱导血管生成的生物活性， 就可以刺激移植或迁移到支架材料上的细胞释放血管内皮 生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，然后与成骨细胞和 内皮细胞的共培养体系相结合，将会增加在新骨生长过程 中诱导快速血管化的可能性。 锶 是 一 种 具 有 促 进 骨 形 成 和 减 少 骨 吸 收 双 重 作 用 的 骨 组 成 元 素 15-17， 同 时 锶 元 素 能 有 效 提 高 材 料 的 生 物 相 容 性 和 生 物 活 性 。 聚 磷 酸 钙 是 一 种 具 有 优 良 机 械 性 能 和 生 物 相 容 性 的 生 物 陶 瓷 骨 组 织 工 程 材 料 ， 在 骨 修 复 方 面 受 到 广 泛 关 注 18-19。 前 期 实 验 发 现 掺 锶 聚 磷 酸 钙 材 料 对 于 单 独 培 养 的 内 皮 细 胞 和 成 骨 细 胞 的 行 为 有 显 著 促 进 作 用 20-21。 实 验 在 3 种 不 同 支 架 材 料 掺 锶 聚 磷 酸 钙 、 聚 磷 酸 钙 和 羟 基 磷 灰 石 上 将 成 骨 细 胞 与 内 皮 细 胞 以 一 定 比 例 共 培 养 ， 研 究 掺 锶 聚 磷 酸 钙 支 架 材 料 对 共 培 养 体 系 的 细 胞 行 为 和 血 管 内 皮 生 长 因 子 ， 碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 表 达 的 影 响 及 机 制 。 1 材料和方法 Materials and methods 设计：体外细胞学观察实验。 时间及地点：于2011年7月至2012年7月在四川大学 完成。 材料： 细胞株 ：人脐静脉内皮细胞株HUVEC，由四川大学 华西医院移植工程与移植免疫实验室提供；人成骨肉瘤 MG63细胞株，由四川大学华西医院移植工程与移植免疫 实验室提供。 实验方法： 支架材料的制备 ：按锶/钙一定摩尔比例称取碳酸锶、 碳酸钙，与磷酸溶液反应制备磷酸二氢盐，无水乙醇除去 多余磷酸。置混合盐于坩埚内，500 煅烧，升温使熔融， 再淬火得到无定型烧料。研磨筛分烧料，取粉末与一定量 的致孔剂和黏合剂混合，压制成直径10 mm，高2 mm的 型胚，一定温度下烧结制得聚磷酸钙和含锶量为8%的掺 锶聚磷酸钙多孔支架，射线辐照灭菌后备用。 内皮细胞和成骨样细胞的培养 ：将冻存的内皮细胞 HUVECs和人成骨肉瘤 MG63细胞复苏，用含体积分数为 10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的 RPMI1640培养液于 37 、体积分数为5%CO 2的饱和湿 度下培养，隔天换液。取第3代细胞备用。 细胞与支架材料的复合培养 ：在接种细胞前，将射 线辐照灭菌后的掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙和羟基磷灰石支 架材料在RPMI-1640培养液中浸泡12 h，其中羟基磷灰石 和聚磷酸钙作为实验对照。将第3 代两种细胞用0.25%胰 掺锶聚磷酸钙对共培养成骨细胞与内皮细胞影响实验的试剂与仪器： 试剂与仪器 来源 羟基磷灰石 四川大学生物材料工程研究中心 碳酸锶、碳酸钙、磷酸 分析纯，成都市科龙化工试剂厂 RPMI1640 培养基 美国 Gibco 公司 小牛血清 Hyclone 公司 MTT 美国 Sigma 公司 MCO-18AIC 型 CO2 恒温培养箱 日本三洋公司 酶联免疫检测仪 美国 BIO-RAD 公司 JSM-5900LV 扫描电子显微镜 日本电子株式会社 ELISA 试剂盒 R5:2983. 2 Yu H,VandeVord PJ,Mao L,et al.Improved tissue-engineered bone regeneration by endothelial cell mediated vascularization. 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