NGS与感染性疾病的精准治疗ppt课件

1 NGS和感染性疾病的精准 治疗 2 3 2003年完成了人类基因组计划 4 该计划的完成使得人们强烈的意识 到人们需要更多更好的技术与数据 分析能力来回答随之而来的一系列 生物学问题。 然而，通量的限制以及居高不下的 测序成本成为了人们进一步了解基 因组的一道坎。 5 下一代测序（ next-generation sequencing， NGS） 2000年之后推出的高通量测 序平台很好地解决了这个问 题，人类基因组测序的成本 直接因此下降 50000倍 产生了一个新的名词： NGS 6 一、 NGS是什么？ （一）传统的测序方式 大规模平行签名测序（ Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、 聚合酶克隆（ Polony Sequencing）、 454焦磷酸测序（ 454 pyrosequencing）、 Illumina (Solexa) sequencing、 ABI SOLiD sequencing、 离子半导体测序（ Ion semiconductor sequencing）、 DNA 纳米球测序 （ DNA nanoball sequencing）等 7 （二） NGS(next generation sequencing) 包括二代的大规模平行测序和三代的单分子测 序。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改 变，一次对几十万到几百万条 DNA分子进行序 列测定 被 称为下一代测序技术 (next generation sequencing)足见其划时代的改变 8 同时高通量测序使得对一 个物种的转录组和基因组进 行细致全貌的分析成为可能 ，所以又被称为深度测序 9 （三）测序平台 1、 Illumina公司的 Solexa测序平台 2、 Roche公司的 454测序平台 3、 ABI公司的寡核苷酸连接检测平台 (SOLiD) 10 （四） NGS特点 1、不同平台测序方法不同，但 原理有着共通之处，都是将基因 组 DNA随机切割成小片段 DNA， 再通过构建文库、 PCR扩增等技 术流程获得测序模板进行测序及 数据分析，相对于 Sanger测序 来说通量高、速度快、费用低 11 （四） NGS特点 1、高 准确性，高通量，高灵敏 度 2、可 以同时完成传统基因组学 研究（测序和注释）以及功能基 因组学 （基因表达及调控，基因 功能，蛋白 /核酸相互作用）研 究 12 （四） NGS特点 2、越来越多地应用第二代测序技术 来解决生物学问题。比如在基因组 水平上对还没有参考序列的物种进 行从头测序，获得该物种的参考序 列，为后续研究和分子育种奠定基 础；对有参考序列的物种，进行全 基因组重测序，在全基因组水平上 扫描并检测突变位点，发现个体差 异的分子基础。 13 14 15 中科院动物研究所已经测 序、组装和分析了 38只野生 金丝猴的基因组突变。这项 研究结果发表在国际分子生 物学和进化领域的权威期刊 Molecular Biology and Evolution 16 二、 NGS可以为感染性疾病 做什么？ 17 （一）宏基因组学（ Metagenomics ） 又 叫微生物环境基因组学、元基 因组学。 它 通过直接从环境样品中提取全 部微生物的 DNA,构建宏基因组 文库，研究环境样品所包含的 全 部 微生物的遗传组成及其群落功 能。 18 19 对特定环境中全部微生物的 总 DNA（也称宏基因组， metagenomic）进行克隆， 并通过构建宏基因组文库和 筛选等手段获得新的生理活 性物质，通过系统学分析获 得该环境中微生物的遗传多 样性和分子生态学信息 20 宏 基因组学研究的对象是特定 环境中的总 DNA，不是某特定 的微生物或其细胞中的总 DNA ，不需要对微生物进行分离培养 和纯化，这对我们认识和利用 95%以上的未培养微生物提供 了一条新的途径。 21 不 仅能够从整体上认识微生物 群落自身数量和组成结构，而且 可以认识微生物群落自身及其与 宿主之间的进化关系，研究不同 状态对微生物群落结构和功能的 影响，分析人类正常菌群和疾病 状态下的结构和功能特征。 22 肠 道微生物宏基因组学与人体 代谢、免疫等各方面联系紧密， 已成为近年来热门的研究主题， 肠道菌群和糖尿病、肥胖症等代 谢性疾病的关系被不断深入研究 ，对于药物和肠道微生物群落的 相互影响也在不断探索 23 24 （二）精准医学 25 1、第二届感染性疾病精准医学高峰论坛 感染性（传染性）疾病危害严重，精 准诊断是实现其精准防控的前提。 目前针对性使用抗生素是一个重大课 题，另外即时快速病原诊断、未知病 原鉴定、混合感染病原诊断、全病程 病原监测等问题都值得重视和研究。 26 针对感染这一重大医学问题，需要将 基因检测与传统检测相结合，加快将 最新的生物科技转化成先进生产力， 应用于临床感染精准诊疗 。 基 于下一代测序技术（ NGS）的宏基 因组学检测技术发展迅猛，将有力推 动感染性疾病精准医学发展。 27 NGS在感染性疾病 中的应用 28 NGS技术应用于细菌感染检测 ，明确是否存在细菌感染 对菌株进行分型，获得分子血 清型、耐药基因谱等信息，分析 其菌株进化历史、感染源及感染 路径，有助于疾病预防、诊疗和 疫苗研发等。 29 结核杆菌耐药 菌株培养难度高，时间长，临床检测 受到极大限制。但基因测序技术在检 测其菌株毒力和耐药性上有着极大的 优势，可以快速检测病原体感染及其 耐药性 有望取代现有的培养和分子诊断法 30 病毒 NGS技术主要应用于基因型分 析、耐药突变检测及病毒在宿主 体内演化，以及暴发感染病毒的 快速检测时以协助预防、诊断治 疗及疫苗研究等方面。 31 真菌 通过建立本地真菌基因组学数据并 对比分析，不仅可以进行真菌感染 快速准确诊断，还能够发现不同真 菌特有的功能性基因，研究其致病 机制及药物耐药位点突变，发现新 的药物作用靶位点，从而开发具有 广谱、不良反应低、无交叉耐药性 的抗真菌药物。 32 2011年 5月以德国为中心，欧 洲暴发了一次严重的出血性肠道 感染，科学家对病菌菌株进行全 基因组测序，发现致病元凶为致 死性的大肠埃希菌 O104： H4， 通过对序列的分析推断其感染人 体的途径和致病机制，溯源追踪 了其感染路径，为疫病的诊断和 治疗提供了重要信息。 33 同年 6月法国也发生了类似感染， NGS序列分析发现德国大肠埃希菌 菌株基因多样性远低于法国菌株， 由此确认其为法国暴发病原体的演 化支，明确了感染源 34 北京协和医院在 International Journal of Infectious Diseases 发表了国内 mNGS用于临 床中枢神经系统 (CNS) 感染患者布氏杆菌检出的 文章。 2016年 6月 1日至 2017年 6月 1日临床怀疑 CNS感 染患者的脑脊液样本。 mNGS快速检出 4例患者布氏杆菌感染，结合临床 症状和 RT-PCR结果验证，患者确诊为神经型布氏 杆菌病。 mNGS检出序列数从 11-104不等，覆盖 度从 0.0043%-0.4%不等。 4例布氏杆菌感染的确 诊，展现了 mNGS在临床疑难感染病原检测应用的 突出优势。 35 8月龄患儿 “ 发热 12天，间断抽搐 8天， 睡眠增多 6天 ” 就诊，持续间歇性高热和 抽搐。 通过 mNGS技术检出单纯疱疹病毒 1型 (HSV-1) 序列数高达 35078条，占比 99.66%，覆盖度为 95%，在相对比例和 病毒基因组覆盖度方面都达到了明确诊断 HSV-1感染的强度。 36 随后甘露醇降颅压后，阿昔洛韦抗病 毒及其他对症治疗后患儿痊愈出院。 本文表明除不容易发现的病原外， mNGS针对较为常见的疱疹病毒具有 明确诊断意义，为临床不明原因的 CNS感染性疾病提供了重要的病原学 诊断方法。 37 2014年西非暴发了记录中最大的一 次埃博拉病毒感染，暴发时间长，感 染和死亡人数高，在世界范围内引起 了极大恐慌。 38 通过 NGS技术结合数据分析，研究者 明确了其基因多样性和易突变性及流 行病学特征，追踪其感染起始源及感 染路径，预估了病毒感染人体和机体 免疫反应的过程，详细阐述了其在宿 主体内通过逐渐适应性突变发生的演 化从而减小被免疫细胞识别的机会， 对疫情的预防、控制，疾病的诊断、 治疗和疫苗的研发都起到了极大的促 进作用 39 三、三代测序 美国太平洋生物的单分子实时技术及英 国牛津纳米孔公司的纳米孔单分子测序 技术 特点是不需要进行 PCR扩增，通过不同 手段区分碱基信号差异，直接读取序列 信息，其读长长、高通量，可以对 RNA 和甲基化 DNA序列进行直接测序 40 四、缺点 目前还存在错误率高、成本较高 和生物信息分析软件不够丰富等 缺点。 高通量测序会产生大批量的数据 ，需要进行庞大的数据分析，如 果缺乏 本地数据库 ，运算工作的 成本和时间难以控