病毒感染性疾病的实验室诊断

病毒感染性疾病的实验室诊断 1 病毒的发现与研究历史 v 病毒病由来已久 公元前二至三个世纪 天花 中国 公元十世纪 接种人痘预防天花 1796英国医生琴纳 牛痘使人预防天花 阿里斯多德在公元前四世纪 狂犬病 法国人巴斯德在 1884年 狂犬疫苗 2 病毒学的发展历程 v 病毒的病原研究阶段 v 病毒的化学和结构研究阶段 v 病毒研究的细胞水平时期 v 分子病毒学的研究时期 3 病毒病的病原研究阶段 v 自病毒发现直到上个世纪 30年代初，病毒学研究主要集中在：分离和鉴定 引起各种病毒性疾病的病毒；病毒对疾体所引起的特异性病理效应；病毒 的传播方式和感染宿主范围；各种理化因子对病毒感染的影响等方面 。 v 在这一阶段，人们对病毒本质的认识还很肤浅，认为病毒是一种与细菌类 似的病原体，所不同的仅在于病毒必须在生活的细胞内才能繁殖，再就是 体积十分微小，以致在显微镜下不能见到，能够通过细菌滤器。这也正是 在那一时期把病毒称之为 “超显微的滤过性病毒 ”的原因。 4 病毒的化学和结构研究阶段 v 1934年 M.Schlesinger获得了纯化的噬菌体； 1935年，美国生化学家 Stanley第一次提纯了烟草花叶病毒（简称 TMV），因为这项贡献 1946 年被授予诺贝尔奖，这是病毒学领域第一个获此殊荣的科学家； 1938年 W.J.Elford测定了各种病毒颗粒大小； 1939年， G.A.Kansche在电镜下 直接观察到 TMV ； 1955年， Scaffer和 Schwerdt成功结晶了脊髓灰质炎 病毒，这是第一个被结晶出来的动物病毒；等等。 v 这一阶段，病毒学工作者主要采用敏感动物（如小白鼠）或动物胚胎（ 如鸡胚）来研究病毒，分离鉴定了近百种病毒。同时在机体水平上研究 了病毒的繁殖、发病机理和免疫反应等。只是微生物学的一个分支。 5 病毒的细胞水平研究时期 v 利用大肠杆菌研究噬菌体的感染过程取得了迅速发展 v 组织培养技术开始应用于动物病毒的研究 我国学者黄祯祥早在 1943年就利用鸡胚组织块在试管内进行病毒传代、定量滴定 及中和试验。 组织培养技术对动物病毒研究所作的贡献主要包括：病毒转录新途径和翻译新途径 的发现；病毒对宿主范围的选择；某些肿瘤病毒引起的细胞转化；某些病毒侵染引 起的细胞融合；发现有的病毒核酸由若干片段组成；有的病毒核酸具有极性的不同 ，如小 RNA病毒为正链 RNA病毒，正粘病毒为负链 RNA病毒。 v 植物病毒不断有重要的发现 此阶段，病毒学逐步形成了一门独立的学科。 6 分子病毒学的研究时期 自从 1953年 DNA双螺旋结构理论建立以来，由于分子生物学 的迅速发展，使病毒学的研究步入了分子病毒学的发展时期 ，分子病毒学也正是分子生物学的发展过程中应运而生。分 子病毒学的发展是各相关学科如分子生物学、细胞生物学、 遗传学、免疫学与病毒学理论和技术相互渗透的结果。尤其 是分子生物学新技术的发明极大剌激了分子病毒学的发展。 7 时间 研究者 成果 1953年 Watson,Crick 建立 DNA双螺旋结构理论 ,为分子生物学和分子病毒学的创立奠定基础 1962年 D.L.D.Casfar 阐明病毒的二十面体结构，是对病毒超微结构认识的重大突破 1962年 D.Nathans 进行了噬菌体 RNA的体外翻译 1965年 S.Spiegelman 体外复制出 Q 噬菌体 RNA 1967年 M.Goulian 体外复制 X174 噬菌体 ,对以后阐明 DNA病毒和 RNA病毒的繁殖机制起了重要作用 1967年 T.O.Diener 发现类病毒 ,揭示了自然界存在着比病毒更简单的生物 ,加深了对生命起源的认识。 1968年 P.H.Duesberg 发现流感病毒的多节段 RNA基因组 1970年 P.H.Duesberg 发现 Rous肉瘤病毒含有癌基因 v-src，使人们对肿瘤发生的机制有了更深刻的了解 1970年 H.M.Temin,D.Baltimor 分别发现了病毒的逆转录酶，这是对 Crick 1958年提出的遗传学中心法则的重要补充和发展 1971年 限制性内切酶技术的发现成功地为乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒构建了酶切图谱 1977年 Sanger 完成了 X174-DNA 全部序列的测定，发现了发现了基因重叠现象 1977年 L T Chow 阐明了腺病毒转录过程中的 mRNA拼接现象，从而明确了内含子和外显子的概念 1978年 W Fiers V.B.Reddy 测定了 SV40-DNA的一级结构由 5224个碱基对组成。 SV40是第一个全部核苷酸序列被搞清楚的病毒 分子病毒学的研究时期的研究成果（一） 8 时间 研究者 成果 1979年 T Taniguchi 用载体成功地表达了人干扰素基因 1981年 D.K.Kleid 利用重组 DNA技术制备出口蹄疫病毒疫苗 1982年 J.Summers 发现乙型肝炎病毒 DNA复制中有逆转录过程 1982年 B.Moss，E.Paoletti 用痘苗病毒作为载体表达外源基因 1983年 Montagnier，R.C.Gallo 分别分离到与 AIDS相关的人类逆转录病毒（ HIV） 1985年 H.Vonder Patten 阐明了鼻病毒的晶体结构 1988年 Chuo， Yamaya 用弱病毒全长 cDNA导入产生抗病毒的转化植株 1991年 Han 将 Moloney鼠白血病毒的反义表达序列导入小鼠受精卵中，从而培育成功对该病毒有抗性的转基因小鼠 1992年 Desrosiers 利用 SIV mac239/nef缺失突变株制备出减毒活疫苗，取得了抗 SIV感染成功 1993年 K.Mullis 发明了 PCR仪 1995年 HIV天冬氨酰蛋白酶三维结构的鉴定，使得一些针对病毒蛋白酶活性位点的抑制剂先后问世 1996年 David Ho 利用逆转录酶抑制剂与蛋白酶抑制剂配成的 “鸡尾酒 ”式药，成功地抵抗了 HIV感染 1997年 S.Prusiner 发现羊瘙痒病致病因子是朊病毒，提出疯牛病、 Kuru病等脑退化性疾病是由朊病毒引起，从而获诺贝尔医学奖 分子病毒学的研究时期的研究成果（二） 9 病毒感染性疾病 v 肝炎病毒（ Hepatitis Virus） v 人类免疫缺陷病毒（ Human Immunodeficiency Virus,HIV ） v 人乳头瘤状病毒（ human papillomavirus , HPV ） v EB病毒（ Ebstein-Barr Virus, EBV） v SARS冠状病毒 (SARS-associated coronavirus, SARS- CoV) v 甲型 H1N1流感病毒（ Influenza A(H1N1) virus ） v 手足口病病毒（ Hand, foot and mouth disease Virus ） 10 肝炎病毒（ Hepatitis Virus） 引起肝炎的病毒有多种类型，包括甲型肝炎病毒 (Hepatitis A virus, HAV)、乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus, HBV)、丙型 肝炎病毒 (Hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒 (Hepatitis D virus, HDV)、戊型肝炎病毒 (Hepatitis E virus, HEV)等， 分别能够引起甲型、乙型、丙型、丁型、戊型 5种肝炎症状 。近年又发现有己型肝炎（ HFV引起）和庚型肝炎 (HGV引 起 )出现。 11 （一） 乙型肝炎病毒 结构和特点： HBsAg：是 HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内， 一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体， HBcAb-IgM 提示 HBV处于复制状态 HBeAg： HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好 12 HBV感染的诊断 v ELISA方法，但只能提供血清中的 HBV间接证据，无法证明是否具有 传染性检测血清标本中的 HBSAg， HbeAg，抗 -Hbs，抗 -HBc和抗 - Hbe（两对半）：比较简单，而且敏感性较低。 v 内源性 DNA聚合酶法和斑点杂交分析法：可直接确定临床标本中 HBV DNA的存在。比较敏感，能检测到 0.1pg的 HBV DNA。 v 荧光定量 PCR方法：可检测到 200copy/ml的 HBV DNA。 可 检出杂交法测定阴性而具有不同 HBV血清学标志的血清标本中的 HBV DNA。可检出 HBs Ag阳性而 Hbe Ag阴性携带者的 HBV DNA。 可检出慢性 HBV感染 -干扰素治疗后转阴的患者血清中残存的 HBV DNA。 （一） 乙型肝炎病毒 13 应用核酸扩增技术 (NAT)是降低 HBV残留危险性的重要策略 14 病毒特点： 1. 单正链 RNA病毒 2. E1和 E2区基因高度变异性 （二）丙型肝炎病毒 感染特点： 1. HCV在血中含量极微 输血后肝炎主要致病因子 免疫学标志仅有抗 -HCV，非中和抗体，产生时间不一 有一部分人感染 HCV后，不产生抗 -HCV 感染易于慢性化 (50-85%) 疫苗研制尚不成功 单链 RNA 15 HCV的流行病学 v全世界的感染人群约有 1.7亿 v75% HCV感染发展成慢性 vHCV感染发展成有症状的肝病需要十年以上 v可引起慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌 v通过输血、静脉用药传播 v血清中出现 HCV抗体在感染后 54 192天 16 vELISA方法检测 HCV抗体：筛查试验 vRIBA：确证试验 v HCV RNA检测：确证试验 HCV感染的诊断 17 抗 HCV筛查及确认试验结果的解释 筛查试验结 确认试验结 果 结果报告 解 释 阴 性 不需检测 抗 HCV阴性 未感染 HCV,除非怀疑是最近感染 ,或有其它证据表 明有 HCV感染 阳性且 S/CO 值高 未检测 抗 HCV阳性 提示既往或现症 HCV感染 . 未进行确认验 .S/CO值高 的标本一般均为确认阳性 (95%), 但尚有 5% 的 标本可能为假阳性 ,可在患者要求下进行确认试 验 . 阳性 阳性 抗 HCV阳性 提示既往或现症 HCV感染 阳性 阴性 抗 HCV阴性 未感染 HCV,除非怀疑是最近感染 ,或有其它证据表 明有 HCV感染 阳性 不确定 抗 HCV不确定 不能确定抗 HCV及 HCV感染状态 ,;应再采集另一份 标本重测抗 HCV(1个月 )或 HCV RNA 阳性 HCV RNA阳性 抗 HCV 阳性 HCV RNA阳性 提示活动性 HCV感染 阳性 RIBA 阳性 HCV RNA阴性 抗 HCV 阳性 HCV RNA阴性 抗 HCV阳性提示既往或现症 HCV感染 .单个 HCV RNA阴性结果不能排除活动性感染 阳性 RIBA 阴性 HCV RNA阴性 抗 HCV 阴性 HCV RNA阴性 未感染 HCV 阳性 RIBA 不确定 HCV RNA阴性 抗 HCV 不确定 HCV RNA阴性 抗 HCV筛查结果可能为假阳性 ,此时 ,提示未感染 HCV 18 HCV-RNA定量检测的临床意义 v 早期诊断： HCV感染 1-3W，即可检出 HCV-RNA的存在。 v HCV-RNA载量与抗 -HCV滴度、 ALT水平之间的相关性：抗 -HCV滴 度和 ALT异常率随着 HCV-RNA载量升高而增加。 v HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。 v 慢性丙型肝炎长期抗 -HCV阳性，这时如果进行 HCV-RNA 定量检测 可以鉴别活动性、复制程度。 19 20 人类免疫缺陷病毒 (HIV) 1982年发现第 1例经输血传播 HIV 1985年开始检测血液和血液制品 还可通过母婴垂直传播和性接触传播 可变的潜伏期 普遍的症状包括夜汗、体重下降、 腹泻、鹅 口疮、紫癜 慢性感染，但多种药物治疗可降低病毒滴度 21 人类免疫缺陷病毒 (HIV) 艾滋病有三个特性： v 获得性 -艾滋病并非先天具有，而是后天获得。 v 免疫缺陷 -AIDS的发病机理在于， HIV通过造成人体免疫系 统的损伤，进而导致免疫系统防护功能的减低甚至丧失。 v 综合症 -在临床症状方面，由于免疫缺陷导致的各个系统的 机会性感染、肿瘤而出现复杂的伴随症状群。 22 人类免疫缺陷病毒 (HIV) HIV, the virus that causes AIDS, is shown budding out of a human immune cell. 23 人类免疫缺陷病毒 (HIV) HIV病毒：多亚型和多变异 HIV-1和 HIV-2 M组、 O组和 N组 亚型： A-K CRF：基因重组亚型，主要是 HIV-1型 毒株亚型监测的意义 不同亚型与不同传播途径的关系： B主要通过男性同性性行为和静脉注射 吸毒传播， C主要异性性接触传播 流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的 C亚型和 B亚型 重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的 B/A重组流行、泰国的 A/E重组 24 HIV在外界的抵抗力 v HIV病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很快 消失 v HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比 乙型肝炎病毒（ HBV）的抵抗力低得多 v 对 HBV有效得消毒和灭活方法均适用于 HIV 人类免疫缺陷病毒 (HIV) 25 HIV感染的三种结局 v 典型进展者： 8-10年潜伏期后成为艾滋病人， 80% -90% v 快速进展者： CD4细胞 2-5年内迅速下降， HIV 病毒载量一直维持较高水平，而且分离的 HIV 有均一性。 v 长期存活者（又称长期不进展者）：维持 15年 以上，而且 CD4计数维持正常，在所有感染者 中比例一般在 8%-10%。 人类免疫缺陷病毒 (HIV) 26 HIV感染的三种结局 v 典型进展者： 8-10年潜伏期后成为艾滋病人， 80% -90% v 快速进展者： CD4细胞 2-5年内迅速下降， HIV 病毒载量一直维持较高水平，而且分离的 HIV 有均一性。 v 长期存活者（又称长期不进展者）：维持 15年 以上，而且 CD4计数维持正常，在所有感染者 中比例一般在 8%-10%。 人类免疫缺陷病毒 (HIV) 27 v HIV抗体的检测 v P24抗原的检测 v HIV 核酸检测 HIV感染的实验室诊断 28 29 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 明胶凝集试验 各种快速诊断试剂 检测亚型包括 HIV-1、 HIV-2和 HIV-1型的 O 亚型，窗口期由 10周缩短至 3 4周。 HIV抗体的检测 30 HIV抗体的检测 按 规范 要求，我国采供血机构进行血液筛查和各医疗卫生机 构常规筛查检测宜采用 ELISA法。对用 ELISA试剂或快速诊断试 剂进行的筛查实验如呈阴性反应，即报告 HIV抗体阴性；对呈阳 性反应的标本，筛查实验室应用原有试剂和另外一种不同原理或 不同厂家的试剂进行重复检测，如两种试剂复测均呈阴性反应， 则报告 HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋 病确认实验室进行确认。筛查试剂必须是 HIV-1/2混合型、经国家 药品监督管理局 (SDA)注册批准、批检合格、临床评估质量优良 、在有效期内的试剂。 人类免疫缺陷病毒 (HIV) 31 免疫印迹试验 条带免疫试验 免疫荧光试验 HIV确认试验 32 ELISA双抗体夹心法 阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为 HIV感染 的辅助诊断依据。 HIV-1 P24抗原检测阴性，只表示在本 试验中无反应，不能排除 HIV感染。 在窗口期检测 P24抗原是早期辅助诊断和进一步缩短窗口 期的一种方法，还可用于 HIV阳性母亲所生婴儿的早期辅 助鉴别诊断。 P24抗原 的检测 33 检测 HIV RNA通常使用 PCR或 RT-PCR技术 ， 核酸序列扩增实验 (NASBA)、分 支 DNA杂交实验等 注意 ： HIV核酸定性检测阴性，只可报告本次实验结果阴性，但不能排除 HIV感染； HIV核酸检测阳性，可作为诊断 HIV感染的辅助指标，不能单独用 于 HIV感染的诊断，报告定性检测结果时还应注明反应条件和所使用的引物 序列。报告 HIV核酸定量检测结果时应按照仪器读数报告结果，注明使用的 试验方法、样品种类和样品量，当测定结果小于最低检测限时，应注明最低 检测限水平，低于最低检测限的结果不能排除 HIV感染。 HIV核酸检测 34 v CD4+T淋巴细胞计数 v 血浆 HIV RNA水平 (病毒载量 ) 这两项实验可以为临床医生提供病人病毒水平、免疫 状态的相关资料，是预测疾病进程的可靠指标，还可 独立预测艾滋病临床过程和生存期。 HIV感染的实验室监测 35 流式细胞仪是检测 CD4+T淋巴细胞计数的标准方法，可 以得出 CD4+T细胞占淋巴细胞的比值及绝对值。 CD4+T 细胞计数是艾滋病诊断、疾病分期的实验室标准指标。 CD4+T淋巴细胞计数 36 HIV病毒耐药分为原发性 (Primary)及继发性 (Secondary) v 原发性 HIV病毒耐药：指那些直接影响抗病毒药物作用靶点的变 异，具有药物特异性，可降低抗病毒药物敏感性 v 继发性变异又称为补偿变异：常出现于原发性变异已存在的病毒 基因组中，原发性变异可造成复制关键酶的改变，导致病毒动力 学的不利，继发性变异可纠正由原发性变异导致的不利，提高病 毒的耐药性，对原发性变异起到保护和促进作用 HIV抗病毒治疗的耐药监测 37 耐药性检测有两种方法 v 表型检测：通过用药期间的病毒培养进行 v 基因型检测：通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变 v 基因型检测的费用较低，较容易，可在样品收集后 1 2周得到结果，但 分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物 及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以 直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵 ，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。 38 人乳头瘤状病毒 （ human papillomavirus, HPV ） v HPV具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮 细胞，人是 HPV的惟一宿主。 v 有 100多个型 v 低危型： HPV 6、 11引起良性病变 (尖锐湿疣、喉乳头瘤等 ) v 高危型： HPV 16、 18引起恶性肿瘤 (宫颈癌、肛门癌、口腔 癌等 ) v 新生儿产道感染。 v 免疫原性低，易形成持续性感染。 39 v 高危型 16.18.31.33.35.39.45.51.52.56.58.59. 68.73.82.亚型 CP8304 v 可能高危型 26.66.53 v 低危型 6.11.40.42.43.44.54.61.70.72.81.cp6108 HPV型别 40 41 HPV中国型别分布 HPV16 (24.5%) HPV52 (16.2%) HPV58 (16.0%) HPV56 HPV31 乌兰娜 ,吴瑞芳等，人乳头瘤病毒基因亚型与宫颈病变的关系 ,中国妇产科临床杂志 HPV16 (32.9%) HPV58 (18.8%) HPV52 (16.9%) HPV18 HPV33 42 Major capsid protein Transforming genes/growth stimulation Minor capsid protein Regulation of viral replication Regulation of viral transcription 呼吸道 传 播 : 空气 飞 沫 ; 接 触 传 播 v 疱疹液中含大量病毒，疱疹破 溃 后病毒排出。 v HFMD为 全球性 传 染病，在全球广泛分布，无明 显 的地域分布 , 但 近 年 EV71在 东 南 亚 一 带 流行 , 引起 较 多的重症和死亡病例。 v 在 80年代和 90年代，中国手足口病的流行主要以 CoxA16为 主， 2008年， CoxA16 和 EV71 共循 环 引起手足口病爆 发 , EV71在大部 分省市 为优势 病毒。 65 手足口病病毒（ Hand, foot and mouth disease Virus ） 66 67 患者年龄分布 手足口病病毒（ Hand, foot and mouth disease Virus ） 67 人肠道病毒感染的一般致病机制 进入途径进入途径 口腔口腔 /呼吸道呼吸道 咽喉及下肠胃道咽喉及下肠胃道 传播传播 扁桃体扁桃体 、 深层淋巴结深层淋巴结 、 肠道淋巴结肠道淋巴结 微病毒血症微病毒血症先天性感染先天性感染 神经系统神经系统心心 脏脏肝脏肝脏 、 胰脏、胰脏、 肾上腺肾上腺 呼吸系统呼吸系统 皮肤及黏膜皮肤及黏膜 病毒血症病毒血症神经系统神经系统 抗体产生抗体产生 、 病毒血症消失病毒血症消失 ， 病毒感染症状改善病毒感染症状改善 飞沫、接触、饮食飞