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陕西理工学院毕业论文黑米的核型分析 【摘要】 染色体核型分析是遗传学研究的重要手段，而水稻染色体形体较小，很难从形态上区分个别染色体。本文作者通过里利用一系列改进的方法获得的水稻双亚黑的染色体核型图，并对其进行了分析,水稻染色体数目为2n=24,核型公式为k(2n)=24=10m+14sm。【关键词】 水稻;染色体;核型分析。引言稻属是禾本科中和人类生活密切相关一个重要的植物类群，该属含有两个栽培种及20余个野生种，起源于南亚和东南亚的亚洲栽培稻o. sativa l.为全球近一半的人口提供粮食，而起源于西非的非洲栽培稻o. glaberrima steud.也对非洲的文明起到了积极的作用，其广泛分布于全球热带和亚热带地区1。水稻是我国栽培面积和总产量均居首位的作物，在我国其总面积、总产量和单位面积产量均居各类粮食作物的首位，现阶段常年种植面积约占粮食作物种植面积的30%，而总产量则占粮食总产量的40%以上；水稻还是公认的禾谷类作物、遗传和分子生物学研究中的模式植物，因此，水稻是一种关系国计民生的重要作物。在我国丰富多样的水稻种子资源中，还蕴藏着为数不少的具有特殊性能和特殊用途的稻作资源2。水稻在单子叶植物中，基因组最小，只有450mb，分布于12对染色体上3，是植物发育生物学和分子生物学中的模式植物之一，在水稻基因组研究中，染色体核型的研究在遗传育种领域中有着重要的意义，水稻染色体的研究可以为进一步探讨水稻的遗传信息及水稻育种中的染色体识别提供依据3。近年来，随着植物分子育种技术的迅猛发展，使得培养高产、优质、多抗性的新品种和新组合的稻种的目标以及获得新的育种的突破已成为可能4。除了染色体数目外，20世纪30年代开始发现染色体形态和大小具有很大的分类价值5。在染色体核型分析中,目前一般采用如下的方法:(1)常规的形状分析。如测量染色体的长度,确定着丝点的位置，副缢痕的位置和存在与否以及随体的有无、形状和大小。(2)带型分析。在染色体组型分析中，现多应用分带技术，根据不同带型，可更精细而可靠地识别染色体的个体性。(3)着色区段分析。在同源染色体之间着色区基本相同，而在非同源染色体之间则有差别。(4)定量细胞化学方法。即根据细胞核、染色体组或每一个染色体的dna含量以及其他化学特性去鉴定染色体。所以水稻的核型分析无论是在分子和遗传的研究领域还是实际的育种领域都有着巨大的价值。水稻的染色体核型分析在植物学家们鉴定新物种，进行育种改良和遗传基因分析的研究工作中也占有重要地位。染色体核型亦称“组型”，是指某一个个体或种的全部染色体的形态结构，包括染色体的数目、大小、形状、主缢痕和副缢痕等特征的总和5。而核型分析是指对细胞染色体的数目、形态、长度、带型和着丝粒位置等内容的分析研究6。不同物种的染色体有着各自特定的形态结构(包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等)特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此可用它作为植物学分类及遗传研究的一个重要手段，使学者们在研究分类有争议的植物时有更多的参考资料，以达到意见上的统一。也是植物种质资源遗传性研究的重要内容,是物种进化关系和物种系统分类的重要参考标准6。稻属染色体组的研究始于morinaga(1937)，核型研究也始于上世纪30年代。国内于80年代才开始对水稻的部分野生稻的核型和分带进行研究。水稻染色体为2n=24，x=12(普通稻)，但是由于水稻染色体较小，细胞质较浓，着色力差，并且在不同品种或同一品种的不同细胞核型之间存在着不同程度的多态性7，8，从而给水稻的体细胞染色体制片带来了许多困难，其核型分析中的绝对长度、相对长度、着丝点位置、具随体染色体数目及其编号顺序等，在不同的报道中也不尽相同，有的甚至有较大差异。在kurate(1978)创立了去壁低渗法5，对水稻染色体制片技术进行了较大的改进，之后陈瑞阳等人1,6在对此法的改进的基础上，又进一步提出新方法。直至1978年，kurata和omura采用酶解火焰干燥法制片2，才从根本上解决了水稻体细胞染色体制片的困难,获得了很好的分裂相。但是，有关水稻核型分析的研究仍然没有最后制定水稻的标准核型分析图。虽然现代分子生物学的研究已把遗传学的研究探入到了分子水平，而核型分析作为一种较古老的细胞遗传学的分析手段，仍然在生物多样性研究中是一个不可忽视的环节 。1材料和方法1.1 材料来源双亚黑：来自于陕西省水稻研究所。1.2 实验仪器及药品恒温箱,水浴锅,冷藏箱,解剖显微镜,日本尼康显微摄影仪，小烧杯,镊子,载玻片和盖玻片,培养皿,胶头滴管,吸水纸，镜头纸,小刀片。2%的纤维素和果胶酶的混合液,1mol/l的hcl,0.075mol/l的kcl前低渗液,甲醇:乙酸=3:1的固定液,0.05%秋水仙素溶液,卡宝品红染液,香柏油。1.3操作方法1.3.1材料制备:水稻种子置26温箱中滤纸培养使其萌发，当根长至0.2cm-1cm时于早晨9:00-11:00取材，用蒸馏水活化20min。1.3.2预处理：将活化后的材料用0.05%的秋水仙素混合液（v秋水仙素：v二甲基亚砜=100：1）在室温下处理30min。1.3.3固定：将处理后的材料水洗，用固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）在4的冰箱中固定24h。1.3.4解离：取出固定后的材料，水洗，用0.075mol/l的kcl于37水浴锅中前低渗30min，再用1mol/l的盐酸在60的水浴锅中解离4min，蒸溜水多次冲洗，切去根尖置于离心管中，用2%的酶液（2%的纤维素酶+2%的果胶酶）在37的水浴锅中解离40min，蒸馏水多次冲洗，再用蒸馏水在室温下后低渗30min。1.3.5染色和压片：将解离后的材料，染色89小时，直接压片，先用滤纸吸掉盖玻片周围多余的染液，将吸水纸盖在盖玻片上，用拇指使劲压平，然后用解剖针柄轻敲盖玻片。1.3.6永久封片：低倍镜下镜检选取较好的片子，冰冻后用刀片将盖玻片和载玻片分离，电吹风吹干后先用二甲苯透明数分钟，最后用中性树胶封片。1.3.7镜检、照相与分析将做好的永久性装片于显微镜下再次检查，找出染色体分散好的细胞进行拍照，选择30个染色体分散良好的有丝分裂中期的细胞进行计数，对其中的5个细胞进行长度测量。按照stebbins以及李懋学和陈瑞阳的标准进行核型分析，染色体相对长度系数按照郭幸荣的方法9。染色体分析采用adobe photoshop软件，模式图的绘制采用excel软件。核型分析：选择分散好、形态好的中期染色体进行显微摄影，并将照片放大。将放大照片上的1个细胞的全部染色体剪下，测量并计算染色体的相对长度(染色体长度与染色体组总长度之比)、相对长度指数(染色体长度与全组染色体平均长度之比)、臂比(长臂与短臂比)，主要观察染色体的长短、着丝粒的位置、有无随体等。核型参数计算公式为：染色体相对长度（%）= 每个染色体长度/染色体组总长度 100；染色体臂比 = 染色体长臂长度/染色体短臂长度，着丝粒位置按levan等6标准计算，核型类型按stebbins7的标准分类。核型分析取5个细胞的平均值6。根据以上几个参数，并结合随体的大小、形状以及随体的有无等对染色体进行测量分类、排列、编号，然后对核型从总体上进行分析和描述。取35个细胞的染色体，每条染色体测量5次后的平均值制成染色体参数表格和核型模式图。选择一个具有代表性的分裂相排成核型模式图，各组染色体排列顺序以染色体总长为准，从长到短依次排列。选择50个染色体数目清晰的分裂中期细胞进行染色体数量统计。本实验细胞核型分析采用levan等8以染色体臂比来确定着丝点位置和郭幸荣等10以染色体相对长度系数将染色体分成4组的染色体分类标准。采用了stebbins9的按核型中最长染色体与最短染色体之比及臂比大于2的染色体所占的比例和arano10提出的长臂总长与全组染色体总长之比的核型不对称系数(ask%)来确定染色体核型不对称程度。2实验结果21 染色体数目实验结果表明，黑米染色体均为二倍体，数目为2n=16，如图2.1。图2.1 黑米的染色体形态图1233456789101112 2.2染色体核型分析黑米的染色体形态见图2.1，核型分析结果见表2.1，核型模式图见图2.2。核型组成为2n=2x=24=10m+14sm，即具有5对中部着丝粒染色体，7对近中部着丝粒染色体，核型类型为表2.1 黑米染色体的相对长度、壁比和着丝粒位置 序号 相对长度（%） 臂比 着丝粒位置 1 11.21 2.71sm 2 10.34 3sm 38.84 1.41 m 4 8.23 2.75 sm 5 8.19 1.92 sm 6 8.15 1.01 m 7 8.02 1.86 sm 8 7.79 1.18 m 9 7.54 2.18 sm 10 7.50 2.22 sm 11 7.33 1.13 m 12 6.68 1.07 m 8642024染色体的相对长度（%）123456789101112染色体编号图2.2 黑米的染色体模式图3实验分析在实验的整个过程中，取材的好坏直接影响试验的成败，所以取材一定要适宜。本次试验取得是种子的根尖，它有很多优点，即不受时间、季节的限制，只要事先培养种子使其萌发生根，就可以用于试验，比较方便。细胞处在分裂中期时染色体最容易观察，但分裂中期持续的时间很短，这就需要对材料进行预处理，以便观察材料中的染色体。本实验进行的预处理是非离体处理，速度较慢，需处理较长时间。所用试剂为秋水仙素，因为用秋水仙素进行预处理的效果较好，所以，在其他的染色体核型分析时也仍较为常用5。固定的目的是用渗透力强的固定液将材料迅速杀死，使蛋白质沉淀，并尽量使其保持原有状态。在对材料固定后，应马上进行解离，因为经过保存过的材料其效果没有固定后立即解离的效果好。固定好的材料如不能及时解离，可将其保存在70%的酒精中。如果不需要保存很长时间，也可将其直接保存在固定液中。在解离过程中，酸解法比较经济，酶解更专一。但是，无论是酶解还是酸解，把握好解离的时间是相当重要的，时间过长或过短都会产生不良的影响11。在对材料进行解离前还需进行前低渗，解离后又进行后低渗，其目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，使细胞膨胀，进而使细胞中本来已经分散的染色体更加分散（其中0.075mol/l kcl溶液对染色体的结构破坏较小，经它处理后，染色体较为明显清洗）。低渗处理的时间也应适当。如果处理时间过长，则会使细胞胀破，多个细胞的染色体混合在一起，给观察和分析造成很多麻烦；反之，则达不到应有的处理效果6。对材料的染色是指用颜料对材料进行处理，仅使染色体染色，而染色质不染色或染色很淡，以便观察和分析。可分为常规染色法和分带染色法。改良石碳酸品红溶液染色克服了石碳酸中含有较多甲醛而使原生质硬化的缺点，并且该染液比较稳定，能存放很长时间。本研究结果表明，高质量的制片对染色体核型分析起着举足轻重的作用。本实验中采用常规制片法，这样可以达到背景为白色的效果，而且细胞几乎可以成单层分布，当然具体压片方法不固定，只要在制片过程中不让盖玻片移动，使细胞和染色体分散开来即可。核型分析便是本次试验的主旨目的，是指对某一物种所特有的一组染色体或一套染色体的形态特征进行分析13，包括染色体数目的确定和染色体形态的分析。在进行核型分析时，通常按李懋学等的标准来确定染色的数目、分析染色体的形态14，按stebbins的方法确定染色体核型的类别10。4结果讨论根据10个较良好的黑稻染色体分裂相的结果显示，所有分裂相染色体的数目均为24条，占计数细胞的100%，因此，确定黒稻的染色体数目为2n=24。根据李懋学等1，3染色体分类标准，黒稻的12对染色体中，除第3,6.8,11,12对染色体为中部着丝粒外其他的全部为近中部着丝粒。核型公式为2n=2x=10m+14sm。最长染色体和最短染色体的相对长度比为1.68；臂比的变化在1.013.01之间，未观察到随体。根据stebbins等10的观点：高等植物核型进化的基本趋势是由对称向不对称方向发展，因此可以推测黒稻在进化地位中可能处于比较原始的地位。,参考文献1张建明,朴钟泽,陆家安等.中国特种稻的研究利用先转与前景.上海农业学报,2002,18,1-6.2 闫素丽,安玉麟,孙瑞芬等.染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展.内蒙古农业大学,呼和浩特 010019; 2 内蒙古农牧业科学院,呼和浩特 010031.1-6.3 程祝宽,颜辉煌,顾铭洪.水稻染色体的长度顺序和编号问题.中国科学院遗传研究所,北京 100101:扬州大学农学院农学系,扬州225009.2-5.4 吴士筠,吕 璐,覃 瑞,宋发军.水稻广陆矮4号与杂交水稻杂优1号染色体核型分析.中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室,武汉430074.第23卷第1期.2-6.5吴甘霖.核型分析在细胞分类学中的应用.安庆示范学院生命科学系,生物学杂志.安庆 246011.2006年2月.6 刘永安,冯海生,陈志国.植物染色体核型分析常用方法概述j.贵州农业科学,2006,34(1).2-6.7 赵侯明,宋发军,覃瑞.冬凌草的染色体数目及核型分析j.中南民族大学学报(自然科学版).2007,12:26(4).2-5.8刁英.染色体核型研究的方法及应用.渝西学院,生命科学系,重庆 永川 402168:武汉大学,发育生物学实验室,湖北 武汉 430072.3-6.9贾彩红,代正福,徐碧玉等.长春花核型的研究.中国热带农科院热带生物技术研究,海口 571101:中国热带农科院热带作物品种资源研究所,海南 571737.3-6.10 stebbins gl.chromosomal evolution in higher plantsm.london:edward arnold,1971,85-104.11乔永刚,宋芸.利用excle制作核型模式图.山西农业大学,生命科学学院,山西 太谷 030801.4-6.12 王冰,李坤,尹海波. 山莴苣染色体的核型分析j.论著. 2005)05-033