粉纹夜蛾胚胎细胞系无血清悬浮培养条件的初探 毕业论文.docx

青岛农业大学毕 业 论 文（设计） 题 目：粉纹夜蛾胚胎细胞系无血清悬浮培养条件的初探 姓 名： 学 院： 农学与植物保护学院 专 业： 植物保护 班 级： 2009级4班 学 号： 20093608 指导教师： 年 月 日毕业论文（设计）诚信声明本人声明：所呈交的毕业论文（设计）是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，论文中引用他人的文献、数据、图表、资料均已作明确标注，论文中的结论和成果为本人独立完成，真实可靠，不包含他人成果及已获得青岛农业大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文（设计）作者签名： 日期： 年 月 日 毕业论文（设计）版权使用授权书本毕业论文（设计）作者同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文（设计）的复印件和电子版，允许论文（设计）被查阅和借阅。本人授权青岛农业大学可以将本毕业论文（设计）全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本毕业论文（设计）。本人离校后发表或使用该毕业论文（设计）或与该论文（设计）直接相关的学术论文或成果时，单位署名为青岛农业大学。论文（设计）作者签名： 日期： 年 月 日指 导 教 师 签 名： 日期： 年 月 日青岛农业大学毕业论文（设计）附件材料 题 目：粉纹夜蛾胚胎细胞系无血清悬浮培养条件的探究 姓 名： 朱殿霄 学 院： 农学与植物保护 专 业： 植物保护 班 级： 2009级4班 学 号： 20093608 指导教师： 郑桂玲 年 月 日 青岛农业大学毕业论文（设计）立题表立题题目题目来源来源于生产实际 来源于科研项目 其他 题目性质基础研究 应用研究 应用基础研究 其他题目完成形式毕业论文 毕业设计 申请立题教师职称从事专业立题说明：教研室意见教研室主任签名： 年 月 日毕业论文（设计）领导工作小组意见： 教学院长签名： 年 月 日青岛农业大学毕业论文（设计）任务书论文（设计）题目 粉纹夜蛾胚胎细胞系无血清悬浮培养条件的初步探究 要求完成时间 论文（设计）内容（需明确列出研究的问题）： 1. 粉纹夜蛾胚胎细胞系 qb-tn9-4s在sf-900 无血清培养基悬浮培养的实验材料和方法 2.粉纹夜蛾胚胎细胞系 qb-tn9-4s在sf-900 无血清培养基悬浮培养时细胞形态的观察 3.粉纹夜蛾胚胎细胞系 qb-tn9-4s在sf-900 无血清培养基悬浮培养时不同转速的设定、细胞密度的测定及生长曲线的绘制 4.在悬浮培养过程中细胞接种浓度、保护剂对细胞的影响的探究5.结果分析与讨论 资料、数据、技术水平等方面的要求 1根据论文题目和内容要求，查阅相关文献。培养自主实验学习的能力。 2. 了解掌握国内外研究现状。 3. 利用前人研究，具有一定的总结能力。 4. 严格遵守纪律，服从指导老师的安排，在老师的指导下，认真合格的完成论文。 指导教师签名： 年 月 日目 录摘要1abstract1引言11 材料与方法41.1 材料 41.2 方法 42 结果与分析52.1 细胞悬浮培养的一般规律52.2 细胞接种浓度的影响62.3保护剂影响实验63 讨论7 31 关于最优接种浓度讨论732 关于保护剂影响的讨论83.3 误差分析84结语8参考文献9粉纹夜蛾胚胎细胞系无血清悬浮培养条件的初探 植物保护学院 : 朱殿霄指导教师: 郑桂玲 摘要： 本文研究了粉纹夜蛾胚胎细胞系(qb-tn9-4s)在无血清培养基sf-900 中培养的生长过程, 分析了细胞接种浓度、保护剂对该细胞生长的影响，测定了qb-tn9-4s在无血清培养基条件下的细胞群体倍增时间。实验表明粉纹夜蛾胚胎细胞系(qb-tn9-4s)在无血清培养基sf-900 中的最优接种浓度为4105cellsml,保护剂pluronic f-68 对qb-tn9-4s有较明显的保护作用。关键词：粉纹夜蛾胚胎细胞系、生长曲线、接种浓度、群体倍增时间 、保护剂、the research for trichoplusia ni embryonic cell lines in serum-free suspension culture conditions probestudent majoring in zhudianxiaotutor zhengguilingabstract:in this paper, trichoplusia ni embryonic cell lines qb-tn9-4s in serum-free medium sf-900 cultured growth process, analysis of the cell inoculum, the protecting agent for the cell growth was measured qb-tn9 -4s in serum-free medium under the conditions of the cell population doubling time. experiments show that embryonic cells trichoplusia ni qb-tn9-4s in serum-free medium sf-900 the optimal inoculum of 4105cells/ml, protective agent pluronic f-68 对 qb-tn9 -4s have a more significant protective effect.keywords: trichoplusia ni embryonic cell lines、 growth curve、 inoculum concentration,、population doubling time、 the protecting agent 引言无血清培养基是在天然培养基、合成培养基之后获得迅速发展的一类培养基。该类型培养基可以在不添加血清的情况下培养特殊类型的细胞。无血清培养基可以在稳定的外部环境下进行细胞培养，可以最大限度的避免外来因素的影响。可以为昆虫细胞悬浮培养提供稳定的培养介质。传统的血清培养基保存期短，易腐变，添加血清可能改变某些细胞的理化性质，导致实验产生外源性误差，例如：血清可能促进成纤维细胞细胞的生长同时抑制表皮细胞生长；同时血清含一些对细胞产生毒性的物质，影响细胞生长甚至造成细胞死亡。血清制作成本高、过程复杂、批间差异大，对转基因蛋白生物药品分离纯化工作造成了极大困难。与血清培养基相比无血清培养基具有以下明显的优点：(1)可以避免不同血清制品的差异性，使重复实验的可靠性极大提高。(2)减少外来物质对细胞的毒性作用和污染。(3)可以促进体外培养细胞的分化。(4)无血清培养基成分稳定， 有利于细胞产物的分离纯化。 细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术1。非贴壁依赖性细胞的一般采用悬浮培养的方式培养，分散于培养基中的细胞更容易与营养物质接触和交流，通过振荡或转动装置使细胞悬浮于培养基中生长或维持。由于理化性质的稳定，在悬浮培养状态下细胞型态能保持一致，这有利于进行生理生化活动的研究和各种遗传操作，这也为昆虫细胞的大规模培养提供前期技术基础。但是细胞悬浮培养技术在国内应用还不广泛，生物制品生产仍采用落后的的转瓶细胞培养方式。因为细胞悬浮培养相对于传统的转瓶培养有巨大的优势，悬浮培养技术必将取代转瓶培养技术成为进行生物药品研制的主流技术。应该认识到，进行无血清培养和昆虫细胞悬浮培养的研究只是进行大规模细胞培养的基础工作，发展真正的动力是市场对生物制品的巨大需求。生物制品竞争的实质是生物制品核心技术的竞争，首先掌握了无血清技术和大规模细胞悬浮培养技术，提高了产品产量和质量降低了生产的成本，就能在下一轮行业发展中掌握市场主动权。粉纹夜蛾胚胎细胞系群体倍增时间短，杆状病毒和外源蛋白产量高，该细胞原代培养时贴壁培养，生长缓慢，悬浮培养时细胞增值迅速，最大生长密度较其他细胞系高。粉纹夜蛾胚胎细胞系在科研及生产中有较广泛的应用，因此探究该细胞的大规模培养条件有重要意义。基于无血清培养技术和细胞悬浮培养技术的重要应用前景，本实验使用粉纹夜蛾胚胎细胞系，对大规模细胞培养所需的条件进行了初步探索，掌握了大规模细胞培养的条件，对于进行新药、新疫苗、昆虫抗性机理、动物遗传学的探究等科研进展将有重要推动作用。1 材料和方法1.1 材料1. 1. 1 细胞：粉纹夜蛾胚胎细胞系qb-tn9-4s，由青岛农业大学无脊椎动物细胞中心提供。1. 1. 2 培养基：细胞生长所用培养基均为sf-900 无血清培养基，天津美孚生物制品有限公司生产。113 磁力搅拌器： 524g磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司制造。114细胞保护剂：pluronic f-68，美国sigma公司生产的lot rnbb9849 exp.08/13。11倒置显微镜：由日本尼康光学设备公司制造。1.2方法 121台盼蓝染液：用电子天平称取台盼蓝4g，充分研磨后加蒸馏水至100ml，放于冰箱中4保存。使用时用pbs稀释至0.4%，取适量细胞悬液,加入台盼蓝染色液,混合均匀后迅速用血球计数板计数，放于倒置显微镜下观察，活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。记录活细胞数和死细胞数，算出活细胞数占死细胞数的比例即为此时的细胞活性。122血球计数板使用方法：用血球计数板（如图3）计数时使用消毒灭菌的移液管吸取细胞液1ml于血球计数板上，用五点计数法计数后按如下公式进行计算细胞浓度。细胞个数1ml80个小方格细胞总数/ 80 40010000稀释倍数 图31. 2. 3 传代培养：先用移液管吸取细胞液，然后将细胞液喷于培养瓶内，重复此过程将细胞搅匀，将细胞悬液分成两瓶，一半转入新的培养瓶，然后添加培养基到适宜的体积。刚开始细胞生长不稳定，待细胞稳定后进行下一次传代培养，大约3到4天传代培养一次。（见装置图1）由于能贴于壁上生长的细胞均为具有活性的细胞，所以计数前只要倾去旧培养基,加入染色剂 ,剧烈摇晃,用血球计数板即可测定该时刻的活细胞数。124悬浮培养：取原代培养中处于对数生长期，经选拔的粉纹夜蛾胚胎细胞qb-tn9-4为种子细胞,弃去旧培养基,加入sf-900 培养基，制成细胞悬液,摇匀后将其加入无菌转瓶中,装液量为125ml ,旋好塞子，于28 培养箱培养,控制转速100r/ min ,间隔24h 无菌取样一次,倒置显微镜下观察，血球计数板计数，台盼蓝染色法确定活细胞数（装置见图2）。 装置图1 装置图2 图1 图21.2.5不同细胞接种浓度 ：试验在培养体积125ml,温度28,转速100 r/ min情况下分别设定细胞浓度为1105cellsml、2105cellsml、3105cellsml、4105cellsml、5105cellsml。接种时应先对无菌操作台进行处理，先用酒精擦拭，然后打开紫外灯照射25分钟，防止细胞污染。转移细胞时，用吸管从培养瓶的侧口处接种，不要打开培养瓶上方盖子。转移结束，应迅速拧紧盖子。以24 h 为时间间隔取样, 分别测定不同培养条件下细胞生长密度,观察细胞状态， 绘制细胞生长曲线，并作图，运用公式计算群体倍增时间。昆虫细胞倍增时间是在细胞浓度增加倍所用的时间,这可以用公式dt=（tlg2）/(lgnt-lgno)计算。其中t为培养所用的时间，no为实验开始时初次记下的细胞数，nt为t时间后测得的细胞数（一般no选择接种细胞24小时后的）。1.2.6保护剂对比实验; 取浓度为4105cellsml的细胞液两组，在温度28，转速为120r/min的情况下进行悬浮培养，其中一组内为纯的细胞液作为对照，另一组内加入细胞保护剂，在无菌条件下每隔24h进行一次采样观察并记录两组细胞生长状况以及细胞形态的变化，进行对比最后的处细胞保护剂对细胞的形态、生长状况的改善。2结果与分析21 qb-tn9-4s悬浮培养的生长规律：由粉纹夜蛾胚胎细胞系的生长曲线可知，粉纹夜蛾胚胎细胞系的生长过程依次经过滞后期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。滞后期细胞系对不良环境的抵抗能力弱，细胞生长缓慢，但是细胞代谢活力和细胞合成能力强。此阶段可以看做细胞培养的蛰伏期，细胞接种到培养基后需要一定的适应时间，在此阶段细胞的酶合成能力极强，可以为对数期打下坚实物质基础，此时期的细胞的形态理化性质基本一致。对数期的特点为生长速率最快、代谢旺盛、活细胞数和总细胞数大致接近，此阶段成因为经过滞后期生长，细胞生长成熟，同时培养基也可提供足够的营养物质。稳定期细胞理化性质相对稳定、细胞数量也达到最高峰。在此阶段培养基的营养物质被大量消耗，细胞有害副产物也大量积累，培养基理化性质开始对细胞生长不利。衰亡期特点为细胞开始大量死亡，细胞数量开始急剧下降，在倒置显微镜下观察到大量细胞成团现象，进而细胞破碎，可以观察到细胞碎片。在此阶段外界环境对细胞生长越来越不利、大量的细胞分解，继而导致大量细胞死亡。 图3悬浮培养初期 图4细胞成团现象图5 细胞大部分死亡 图6细胞出现碎片图出现死亡细胞图细胞破碎细胞接种浓度的影响：实验表明在一定的浓度范围内，随着细胞接种浓度的增大，培养基中细胞浓度达到最大值所用的时间逐步减少。当细胞接种浓度为1105cellsml时细胞浓度达到最大值的时间为16 d，峰值浓度为2.61106cellsml（如图7）。当细胞接种浓度为2105cellsml时细胞浓度在第8d达到最大值，但峰值细胞浓度为2.73106cellsml（图7），。由图7生长曲线可知当接种浓度分别为1105cellsml、2105cellsml时，细胞生长耗时长且峰值浓度小，故此两种接种浓度不适合qb-tn9-4s的大规模培养。当细胞接种浓度为3105cellsml时细胞浓度在第8d达到最大值，峰值浓度为4.1106cellsml,较接种密度为1105cellsml、2105cellsml时有大幅提高（图8），此情况下倍增时间为52h。接种密度为4105cellsml，5105cellsml的培养基在均在第6d达到峰值且峰值细胞浓度相近，分别为4.4106cellsml、4.5106cellsml，倍增时间分别为40h和60h。说明在一定细胞接种浓度范围内，悬浮培养的细胞密度峰值并无较大变化，且达到峰值时间亦无明显变化。（如图8）。实验结果表明：综合比较不同接种浓度下达到最优状态的条件，我们认为初始接种浓度4105cellsml是粉纹夜蛾胚胎细胞（qb-tn9-4s）在sf-900 无血清培养基中培养的最优浓度。 表一 细胞接种浓度的影响天数（） 浓度 （105 cellsml）1234511252504570055024003008510258753400325775140011434375600975148031305460750110031303800655012803500440045576752280375021752675872527304100185030509107521762930105600 （105 cellsml） 细胞浓度2105cellsml1105cellsml 图7生长曲线细胞浓度（105 cellsml）5105cellsml4105cellsml3105cellsml。 图8生长曲线2.3 保护剂对细胞的悬浮培养的影响转速120r/min条件下，对两组细胞进行持续的取样观察，记录所得数据见表2。根据所得数据绘制的生长曲线见图9。表2 保护剂对细胞的悬浮培养的影响 天数（） 对照（105cellsml）120r(ck)120+f17.59.252131439.758.7549.259.5514.2515.5627.2524.75716.519.3815.517.3注：ck代表对照，f代表保护剂）（105 cellsml）细胞浓度120+f120r(ck)图9 保护剂对细胞影响的生长曲线图实验结果表明：从细胞浓度的角度看，在细胞培养前期，加入保护剂对于浓度并未产生明显影响，但在衰退期加入保护剂的一组细胞细胞浓度较对照组要高。从形态角度来看，培养到后期加入的保护剂一组细胞成团现象较对照组轻，且成团较为均匀。3讨论31最优细胞接种浓度： 结合昆虫细胞悬浮培养的一般规律，我们认为进行粉纹夜蛾胚胎细胞系qb-tn9-4s大规模培养的最佳接种浓度为4105cellsml。浓度小于4105cellsml时细胞处于滞后期的时间过长，前期消耗大量营养物质限制了后期细胞的生长且进入对数生长期的细胞基数小，细胞增值速度缓慢。浓度大于5105cellsml时细胞增长速度和细胞峰值浓度均未见明显增长，可见细胞接种浓度过高没有必要。当浓度处于最佳接种浓度时，悬浮培养所用时间最短，细胞浓度最高，较符合大规模昆虫细胞培养的条件。3.2关于保护剂对细胞的悬浮培养的影响:细胞保护剂pluronic f-68在工业生产和科研研究中应用很广，它的作用如下：1. 保护培养基中的细胞不受转移和搅拌造成的物理和化学损害； 2.可以促进细胞之间的相互作用，减轻悬浮培养条件对细胞产生的不良影响。我们在粉纹夜蛾胚胎细胞系sf-900 无血清悬浮培养培养中，发现加入细胞保护剂对细胞的生理生化性质都产生了良好的影响，对于细胞的生长能力和细胞的形态均有良好的保护作用。3.3 对于实验过程中可能引起结果存在误差的原因分析 3.3.1 细胞的悬浮培养均需要严格无菌条件，实验的任何一个环节都要认真谨慎，不论是实验操作时使用了任何有污染的仪器、还是操作时不经意间的疏忽，都可能导致实验彻底的失败，因此在实验过程中，要特别注意进行无菌操作。3.3.2 在悬浮培养过程中，为了最终绘出生长曲线图，需要每隔24h进行取样计数，取样时要保证培养瓶内的细胞充分摇匀，且用移液管取样时应劲量在靠近培养瓶底部抽取样品液，若未充分摇匀，则可能计数的误差，影响最终的实验结果。4结语一项新的科学技术的从初步探索到完全成熟需要长期的探索，昆虫细胞的悬浮培养技术需要推陈出新，在传统的装瓶培养的基础上，必须大力发展无血清技术和细胞悬浮培养技术。众所周知，细胞对所处的生长环境极其敏感，而人工模拟细胞生长环境异常困难，因此要做到昆虫细胞的大规模培养，必须准确测量细胞健康生长所需的外部量，而做到对这些外部量的精确掌控还需要进行大量的实践。随着社会对各种生物制剂如：病毒疫苗、特种蛋白、生物激素等需求的加大，在进行细胞悬浮培养实验的设计与研究时需要探索更多的科学方法，更多的外部量需要得到精确测量。为了促进无血清培养和悬浮培养技术在生物工程领域的应用，在以后的科研工作中应重点加强以下几个方面研究：(1)进一步开发和研制新型培养基，当前大规模使用的培养基有许多难以克服的缺点，这已成为细胞培养技术进一步发展的瓶颈，研制和开发新型培养基是当务之急。(2)加大科研力度尽快培养出更多的新型细胞系,当前世界昆虫资源极其丰富，而目前全世界建立的昆虫细胞系较少，能进行大规模应用的细胞系更为稀少，因此建立更多新的细胞系且对已有的细胞系进行深入研究是非常有必要的。(3)摸索昆虫细胞规模化培养方法的新方法，进一步细化无血清技术和昆虫细胞悬浮培养技术的研究。传统的细胞培养技术成本高、产量低，无血清技术和细胞悬浮培养技术还不成熟，进一步探索细胞体外培养的条件，进而实现低成本大规模工业生产是科学研究的重点 12l。 致谢 感谢郑桂玲老师对于我在试验过程中耐心负责的指导，郑老师负责的工作精神和高尚的人格魅力将使我终生受益；感谢平日的学习过程中给予细心帮助的各