王镜岩《生物化学》第三版考研笔记(提要版本071页)

王镜岩王镜岩生物化学生物化学第三版第三版 考研笔记（提要版本考研笔记（提要版本 071071 页）页） 内容提要： 1、氨基酸与蛋白质 氨基酸分类：常见蛋白质氨基酸，不常见蛋白质氨基酸，非蛋白氨基酸；氨基酸的酸碱 化学，氨基酸两性解离，氨基酸的等电点；氨基酸的旋光性和紫外吸收。 蛋白质的共价结构：蛋白质的化学组成和分类，蛋白质功能，蛋白质的形状和大小，蛋 白质构象和组织层次。 肽：肽键结构，肽的物理化学性质，活性多肽。 蛋白质一级结构测定：Sanger 试剂，DNS 及 Edman 降解，二硫桥位置确定。 蛋白质的三维结构：XRD 原理；稳定蛋白质三维结构的作用力，肽平面和两面角；蛋白 质的二级结构：-螺旋，-折叠片，-转角；超二级结构和结构域；球状蛋白的三 级结构；亚基缔合和四级结构。 蛋白质结构与功能的关系：肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能，镰刀状细胞贫血病；免 疫球蛋白。 蛋白质的分离、纯化和表征：蛋白质分子量测定，沉降分析及沉降系数，沉降系数单位， 凝胶过滤及 SDS-PAGE 法测分子量；蛋白质的沉淀；电泳：区带电泳、薄膜电泳、等电 聚焦电泳、毛细管电泳。 2、酶和辅酶 酶催化作用特点：反应温合、高效、专一、可调节控制；酶活性调节控制：调剂酶浓度、 激素调节、反馈抑制调节、抑制剂激活剂调节、别构调控、酶原激活，可逆共价修饰； 酶的化学本质及其组成，辅酶和辅基，单体酶，寡聚酶和多酶复合体。 酶的命名和分类：习惯命名法；国际系统命名法及酶的编号，六大类酶的特征。 酶的专一性：“锁与钥匙”学说；诱导楔合假说；过渡态理论，过渡态类似物与医药和 农药的设计，催化抗体。 酶的活力测定：酶活力单位，比活力。 酶工程：化学修饰酶，固定化酶，人工模拟酶。 酶促反应动力学：底物浓度与酶反应速度，酶促反应动力学方程式及推导，米氏常数的 意义和求法。 酶的抑制作用：不可逆抑制和可逆抑制及动力学判断，一些重要的抑制剂，有机磷农药 和磺胺药作用机制。 温度、PH、激活剂对酶反应影响。 酶的作用机制：酶活性部位及研究方法；影响酶催化效率的有关因素：临近和定向效应、 底物形变和诱导契合、酸碱催化、共价催化、金属离子催化、多元催化和协同效应、微 环境影响；溶菌酶作用机制和胰凝乳蛋白酶。 辅酶的结构与活性部位：vit.B1和 TPP，维生素 PP 和辅酶、辅酶，vit.B2和黄素辅 酶，泛酸与辅酶 A，vit. B6及其磷酸酯，vit. B12，生物素，叶酸，硫辛酸。 2 3、氨基酸代谢 氨基酸的脱氧、转氨和联合脱氨基作用，氨基酸脱羧基作用。 尿素的形成：氨的转运和尿素循环。 氨基酸碳骨架的氧化途径，生酮氨基酸和生糖氨基酸。 由氨基酸衍生的生物活性物质：氨基酸与一碳单位，酪氨酸及儿茶酚胺类物质，色氨酸 衍生物，组胺，牛磺酸。 4、氨基酸及其重要衍生物的生物合成 必需氨基酸；氨基酸的生物合成。 氨基酸几种重要衍生物：NO 的形成，谷胱甘肽，肌酸，血红素，胆红素。 5、糖代谢 糖的生物学作用：糖的结构特点和糖工程。 糖酵解作用：酵解和发酵，酵解全过程和反应步骤；酵解过程中能量转变的估算；丙酮 酸去路。 柠檬酸循环：丙酮形成乙酰 CoA，柠檬酸循环概貌和反应步骤；柠檬酸循环的化学总结 算。 生物氧化 电子传递和氧化磷酸化：氧化还原电势；电子传递和氧化呼吸链，电子传 递抑制剂；氧化磷酸化作用，化学渗透假说，氧化磷酸化解偶联和抑制剂。 戊糖磷酸途径及生理意义；葡糖异生作用及途径；糖原的分解与生物合成。 6、脂质和生物膜 脂质：脂肪酸结构特点，必需多不饱和脂肪酸。 磷脂：甘油磷脂，卵磷脂，脑磷脂，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酰甘油，缩醛磷 脂；鞘磷脂，鞘氨醇和神经酰胺。 糖脂：脑苷脂，神经节苷脂。 类固醇，胆固醇。 生物膜的组成与性质：膜脂，胆固醇对膜流动性的调节作用；膜蛋白功能和糖的细胞通 信作用；生物膜分子结构的作用力和主要特征。 生物膜与物质运输：被动运输与主动运输，钠钾泵，生物大分子跨膜运输。 人工模拟膜：模拟膜的功能；模拟膜主要类型：LB 膜，BLM 和脂质体 7、核酸 核酸研究进展：生物技术的兴起，转基因产品，基因工程，基因芯片，人类基因组计划。 核酸的种类和生物功能。 核酸的结构：碱基、核苷与核苷酸；核酸的共价结构，DNA 双螺旋结构，DNA 的拓扑异 构，DNA 的四级结构；mRNA、tRNA 和 rRNA 的高级结构。 核酸的物理化学性质：核酸的酶水解和核酸的酸碱性质，核酸的紫外吸收。 核酸的变性，复性及杂交。 8、核酸的降解 核酸和核苷酸的分解代谢：嘌呤碱的分解，痛风病起因及别嘌呤醇作用机制； 嘧啶碱的分解。 核苷酸的生物合成：嘌呤核糖核苷酸的从头合成及补救途径，抗癌和杀菌剂作用原理； 嘧啶环的合成；脱氧核糖核苷酸的合成，5-Fu 和氨甲喋呤的抗癌作用机制。 9、DNA 的复制和修复 DNA 的复制：DNA 的半保留复制，复制叉；DNA 聚合酶及 DNA 聚合要素，DNA 连接酶和拓 扑异构酶。 3 DNA 半不连续复制和冈崎片段；DNA 复制的起始、延伸和终止；DNA 复制的复杂性。 DNA 损伤修复：错配修复，直接修复，切除修复，重组修复和应急反应。 10、RNA 的生物合成和加工 DNA 指导的 RNA 合成，RNA 聚合酶，不对称转录；启动子和转录因子，终止子和终止因 子；转录的调节控制，操纵子模型；转录反应四阶段。 RNA 生物合成的抑制剂：嘌呤和嘧啶类似物，DNA 模板功能抑制物，RNA 聚合酶抑制剂。 RNA 转录后加工：原核生物中 RNA 的加工，真核生物 RNA 的加工，RNA 拼接、编辑和再 编码，酶性核酸；RNA 生物功能多样性。 在 RNA 指导下 RNA 和 DNA 的合成：RNA 复制和 RNA 病毒复制的重要方式，RNA 的逆转录 和逆转录酶。 11、蛋白质生物合成 遗传密码：三联密码，遗传密码的基本特性。 蛋白质合成及转运：m-RNA 是蛋白质合成的模板，t-RNA 转运氨基酸，核糖体是蛋白质 合成的工厂。翻译的步骤。 蛋白质运输及翻译后修饰。 12、 基因工程 DNA 克隆的基本原理：DNA 限制酶和连接酶，克隆载体与宿主系统，外源基因导入宿主 细胞，分离筛选及克隆；基因文库和 c DNA 文库。 聚合酶链式反应：PCR 基本原理，最适条件和发展应用。 DNA 序列的测定 4 第一章 氨基酸与蛋白质 上册 P123 1. 1 氨基酸 （一）蛋白质水解最后成为氨基酸混合物 酸水解 得 19 种 L-AA，色氨酸破坏。 碱水解 得色氨酸，其余氨基酸消旋破坏。 酶水解 不消旋破坏，但水解不彻底。 （二）-氨基酸的一般结构 生物体内已发现氨基酸 180 种，常见氨基酸 20 种 1. 2 氨基酸的分类：常见蛋白质氨基酸，不常见蛋白质氨基酸，非蛋白氨基酸 （一）常见蛋白质氨基酸，或称基本氨基酸。每个氨基酸可用三个字母或单字母简写表 示。按侧链 R 基不同进行分类。 （1） 按 R 基化学结构分类 1. 脂肪族氨基酸 15 个 .中性氨基酸 5 个 甘氨酸 Glycine 氨基乙酸 Gly G 无旋光 丙氨酸 Alanine -氨基丙酸 Ala A 缬氨酸 Valine -氨基-甲基丁酸 Val V 亮氨酸 Leusine -氨基-甲基戊酸 Leu L 异亮氨酸 Isoleucine -氨基-甲基戊酸 Ile I .含羟基或硫氨基酸 4 个 丝氨酸 Serine -氨基-羟基丙酸 Ser S 苏氨酸 Threonine -氨基-羟基丁酸 Thr T 半胱氨酸 Cysteine -氨基-基丙酸 Cys C 甲硫氨酸 Methionine -氨基-甲硫基丁酸 Met M 酸性氨基酸及其酰胺 4 个 天冬氨酸 Aspartic acid -氨基丁二酸 Asp D 谷氨酸 Glutamic acid -氨基戊二酸 Glu E 天冬酰胺 Asparagine -氨基丁二酸一酰胺 Asn N 谷氨酸胺 Glutamine -氨基戊二酸一酰胺 Gln Q . 碱性氨基酸 2 个 赖氨酸 Lysine ，-二氨基已酸 Lys K 精氨酸 Arginine -氨基-胍基戊酸 Arg R 2. 芳香族氨基酸 3 个 苯丙氨酸 Phenylalanine -氨基-苯基丙酸 Phe F 酪氨酸 Tyrosine -氨基-对羟苯基丙酸 Tyr Y 色氨酸 Tryptophan -氨基-吲哚基丙酸 Trp W 3. 杂环族氨基酸 2 个 组氨酸 Histidine -氨基-咪唑基丙酸 His H 脯氨酸 Proline -吡咯烷羧酸 Pro P （2） 按 R 基极性性质分类 1. 非极性 R 基 8 个 Ala(A) Val(V) Leu(L) Ile(I) Pro(P) Phe(F) Trp(W) Met(M) 5 2. 极性不带电 R 基 7 个 Gly(G) Ser(S) Thr(T) Cys(C) Tyr(Y) Asn(N) Gln(Q) 3. 带正电荷 R 基 3 个 Lys(K) Arg(R) His(H) 4带负电荷 R 基 2 个 Asp(D) Glu(E) 另外 Asx(B)：Asp(D)，Asn(N) Glx(Z)： Glu(E)，Gln(Q) 两个 Cys 常氧化形成胱氨酸 Cystie （二）不常见蛋白质氨基酸 P128 为相应常见氨基酸修饰而来，如：5-羟赖氨酸，4-羟哺氨酸，-羧基谷氨酸， 焦谷氨酸，磷酸丝氨酸，甲状腺素等。 （三）非蛋白氨基酸 P129 1.L 型 -氨基酸衍生物 P128 2.、 或 -氨基酸 3.D-氨基酸，如 D-Glu 和 D-Ala 常见有：肌氨酸（N-甲基甘氨酸） ，-丙氨酸，-氨基丁酸，瓜氨酸，鸟氨酸， 高半胱氨酸。 13 氨基酸的酸碱化学 （一）氨基酸两性解离 -H+ -H+ A+ A0 A- （质子供体） +H+ +H+ （质子受体） Ka1 = A0 H+/ A+ pH=pKa1+lgA0/ A+ Ka2=A-H+/A0 pH=pKa2+lgA-/A0 综合 pH=pHa+lg质子受体/ 质子供体 由此 1.由 pH 值 、AO/A+或 A-/A0测 pKa 2.pKa 为常数， 由 pH 计算 A0/A+或 A-/A0 3.由质子受体/ 质子供体可计算 pH (1)氨解酸的 pKa测定 甘氨酸解离曲线 P131 图 3-9 1 mol Gly 溶于水，溶液 pH=6.0 用 1 mol NaoH 溶液滴定得曲线 B，消耗 0.5mol 时，在 pH9.6 处有一拐点，此时 A0= A- pH=pKa2 测出 pKa2=9.6 用 1 mol Hcl 滴定得曲线 A，当消耗 0.5 mol HCl 时得一拐点，pH=pKa1 测出 pKa1=2.34 带有可解离 R 基的氨基酸相当于三元酸，有三个 pKa值，Glu 和 Lys 滴定曲线见 P132 图 3-10 （二）等电点 氨基酸或其他带电颗粒处于净电荷为零的兼性离子状态时介质的 pH 值，用 pI 表 示，又称等电 pH。 对于 Gly ，pI=5.97，为曲线 A 和曲线 B 之间的拐点，Gly 为兼性离子，净电荷 6 为零。 等电点 pH 值计算： pI=1/2(pKa+)+pKa) Gly pI=1/2(2.34+9.60)=5.97 对于带可解离 R 基的氨基酸 如 Asp 的 pKa，pKa1=2.09 pKa2=3.86 pKa3=9.82 等电点 pIP=1/2( pKa+pKa2)=1/2(2.09+3.86)=2.98 同理推出 Lys pI=9.74 P133 表 3-3 列出 20 种氨基酸的 pKa值和 pI 可做常数用，其中七个氨基酸 R 基 有 pKa值。 1. 4 氨基酸的光学性质 （一）旋光性 一个无旋光 Gly 17 个含一个不对称碳原子，两个含两个不对称碳 原子 Thr 和 Ile，有四种光学异构体。 胱氨酸分子内部对称有内消旋体，有三种异构体。 比旋光为氨基酸物理常数之一，但随 pH 值变化常见氨基酸比旋光度可用来鉴 别氨基酸，P144 表 3-4 （三）氨基酸的紫外吸收 max(nm) （摩尔消光系数） Phe 257 2.0102 Tyr 275 1.4103 Tvp 280 5.6103 蛋白质在 280nm 波长下测光吸收，光吸收值越大，相对纯度越高，常用在蛋白质提 纯过程。 15 蛋白质的共价结构 （一）蛋白质 氨基酸首尾相连形成蛋白质。 平均含氮量为 16% 蛋白质含量 = 蛋白氮6.25 从细菌到人类所有物种的蛋白质都由这一组 20 种氨基酸构成。 1. 单纯蛋白质：仅由氨基酸组成，如核糖核酸酶，肌动蛋白等。见 P158 表 4-1。 2. 缀合蛋白质：除氨基酸外，还有非蛋白部分，称为辅基或配基，如血红蛋白、 核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等，见 P158 表 4-2。 （二）蛋白质功能 生物界蛋白质种类估计有 10101012种，20 种氨基酸全排列为 Anm=2020。 1. 催化（酶）：生物体内化学反应几乎都是在酶催化下进行的。 2. 调节：基因表达调控中的蛋白因子，阻遏蛋白和激素中许多为蛋白质，如胰岛素 等。 3. 转运：血红蛋白输氧气，细胞色素 C 传递电子。 4. 贮存：如种子中谷蛋白，蛋中卵清蛋白。 5. 运动：肌动蛋白，驱动蛋白。 6. 结构：胶原蛋白，-角蛋白。 7. 信息传递：受体蛋白。 8. 防御和进攻：免疫球蛋白，毒蛋白如蛇毒。 9. 异常蛋白：胶质蛋白。 （三）蛋白质的构象 7 为蛋白质具有的特有空间结构或称三维结构。在生理条件下，蛋白质只有一种或 很少几种构象在能量上是有利的。 功能来自构象： 为表达蛋白质结构上不同组织层次，一般采用下列专门术语： 1. 一级结构：又称化学结构，指蛋白质多肽链氨基酸连接在一起的顺序，包括二硫 键位置，为共价键连接的全部情况。 2. 二级结构：多肽链借助氢键排列成自己特有的 -螺旋和 -折叠片段（P161 图 4-1） ，这些片段构成规则结构，并沿一维方向伸展。 3. 三级结构：由二级结构元件（-螺旋，-折叠等）构造成的总三维结构，包括 一级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间相互关 系。 4. 四级结构：寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。 寡聚蛋白是由两条或多条多肽链构成，其中每条多肽链称为亚基或亚单位。 1.6 肽：P162 肽为氨基酸的线性聚合物，蛋白质是由一条或多条多肽链构成。 （一）肽和肽键结构 肽的命名从 N 端开始到 COOH 端，氨基酸残基按顺序从左向右写，-NH2末端 在左，-COOH 端在右。如 Ser-Gly-Phe，称为：丝氨酰甘氨酰苯丙氨酸。 一般氨基酸数目20 的肽为多肽。 （二）肽的物理化学性质 （1） 与氨基酸同，为离子晶格，熔点高，在水溶液中以偶极离子存在。多肽中酰 胺的氢不易解离，肽的酸碱性质主要取决于游离末端的 -氨基和 -羧基， 以及侧链 R 基上的可解离基团，如 Glu 的 -COOH、Lys 的 -NH2。 （2） 滴定曲线：也有等电点，为多价离子等电点。以 Gly-Glu-Lys-Ala 四肽为例 (P166 表 4-6)： 当 pH 10.2，-+NH3解离，2 个 NH2、2 个 COO-，净电荷-2。 pH 在等电点以上（碱性） ，多肽带负电荷。 pH 在等电点以下（酸性） ，多肽带正电荷。 蛋白质滴定曲线更加复杂。 （3） 化学反应 与茚三酮在弱酸性溶液中共热显紫色，为 -NH2反应（注意：伯胺也可使 茚三酮显紫色） ，氨基酸、多肽均有此反应。Pro 为仲胺（亚氨基氨基酸） ，与 茚三酮生成黄色物质。 茚三酮反应可用于定性、定量测定氨基酸和多肽。 肽键的双缩脲反应：多肽，蛋白质中有肽键，有此反应，氨基酸没有此反应。 双缩脲：H2N-CO-NH-CO-NH2 ，P163。 8 双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物（如双缩脲或二肽以上等 多肽）在碱性溶液中能与 CuSO4生成紫红色或紫蓝色复合物，可定性或定量测 定蛋白质含量，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 （三）活性多肽： 动植物体内存在许多具有生理活性的多肽，多肽药物已获得人们的重视。 二肽：肌肽 -Ala-His，抗氧化，抗自由基，消炎，调节免疫。 甜二肽 Aspartame Asp-Phe-OCH3，比蔗糖甜 200 倍。 三肽：谷胱甘肽 -Glu-Cys-Gly，维持红细胞及其蛋白质中 Cys 的-SH 处于还原 态。 四肽：促胃酸激素。 五肽：脑啡肽，内源性吗啡，与吗啡受体结合。 蛋氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheMet。 亮氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheLeu。 八肽：-鹅膏蕈碱，见 P168 图 4-6，剧毒毒素。 九肽：牛催产素，牛加压素（升高血压） ，见 P167，两者只差两个氨基酸，但生 理作用极不相同。 十肽：短杆菌肽，见 P532，为抗生素。 促黄体生成激素释放因子，见 P551，为激素。 十六肽：内啡肽，有镇痛作用。 二十四肽：促皮质素（ACTH） ，治关节炎，已商品化。 二十六肽：蜂素溶血肽，抗关节炎。 五十一肽：胰岛素，降血糖。 以活性多肽研究为基础的药物研究： 血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂（ACEI）的开发是近代高血压治疗史上 的重大进展。 人体内存在的血管紧张素（Ang）为十肽，无活性，但在 ACE 作用下 转化为血管紧张素（Ang）为八肽，具有收缩血管平滑肌作用，使血压升高。 ACE DRVYIHPFHL(Ang) DRVYIHPF(Ang)。 ACEI 可使 ACE 失活，使 Ang不能形成 Ang，从而降血压，研究 Ang 活性部位，作用机理，进而设计并合成 ACEI，已开发出二十多种降压药物， 如巯甲丙脯酸（Captopril） 、依那普利（Enalapril） 、赖诺普利（Lisonopril）等。 1.7 蛋白质一级结构测定 ：P168 测定蛋白质中共价键连接的全部情况，包括存在的链内、链间的二硫键位置，氨基 酸数目、类型和顺序。 蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构，而三维结构决定其生物活性和功能。蛋白质中 氨基酸顺序是由基因决定的，是联系 DNA 遗传信息和蛋白质生物功能的桥梁。 蛋白质中氨基酸顺序揭示其进化史，具有同一祖先的蛋白质才有相似的氨基酸顺序。 如细胞色素 C（P182） ，是一种含血红素的电子转运蛋白，存在于所有真核生物的线粒体 中。40 多种物种的细胞色素 C 序列的研究揭示，在细胞色素 C 中含有的一百多个氨基酸 残基，其中有 28 个位置上的氨基酸残基是相同的（P182 图 4-16） ，这些不变残基对于 细胞色素 C 的生物学功能至关重要，由此可根据细胞色素 C 序列的物种差异建立进化树 （P183 图 4-17） 。来自任两个物种的细胞色素 C 间序列的氨基酸差异数目越多则进化位 9 置相差越远。 （一）蛋白质测序 样品纯度应97%，测分子量（允许误差 10%） 。 1. 蛋白质分子中多肽链的数目：测 N-末端和 C-末端残基的摩尔数。寡聚蛋白要用 变性剂将亚基拆开。 2. 每一多肽链氨基酸组成：鉴定 N-末端残基和 C-末端残基，定出氨基酸序列参考 点。 3. 按专一方式断裂成较小的肽片段：可用酶或化学方法完成，并用多种断裂方法， 将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段。 4. 侧各肽段氨基酸序列：常用 Edman 降解法，用自动序列分析仪。 5. 测定片段次序：用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。 6. 确定二硫键位置。 （二）N-末端和 C-末端氨基酸残基的鉴定 （1）N-末端分析 二硝基氟苯（DNFB 或 FDNB）法：Sanger 反应。 2、4-二硝基氟苯称为 Sanger 试剂，与游离末端氨基反应生成 DNP-多肽或 DNP-蛋白质，再酸性水解生成 DNP-氨基酸（黄色） ，提取分离后可进行鉴定和定量 测定。 此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。 丹磺酰氯（DNS）法：有荧光，灵敏度高。5-二甲氨基-萘-1-磺酰氯（DNS） ，结 构式见 170。 Eman 降解 苯异硫氰酸酯 (PITC) 法：Phenylisothiocyanate(PITC)能顺序从肽的 N-端 将氨基酸残基一个个切下来，还可用来测定氨基酸序列。 PITC 与多肽链每反应一次，得到一个 PTH-氨基酸和少一个氨基酸残基的肽。 PTH (phenylthiohydantoin)： 苯乙内酰硫脲。PTH-氨基酸可用 TLC 或 HPLC 快速测定，由此发展出氨基酸序列自动分析仪。 氨肽酶法： 用外切酶，从 N-末端逐个向里切。最常用的是亮氨酸肽酶，适用于 N-末端残 基的氨基酸被封闭的肽（如环肽） ；N-末端是焦谷氨酸残基时，可使用焦谷氨酸氨 肽酶。 （2）C-末端分析 肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解反应，除 C-末端氨基酸以游离形 式存在外，其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肼化物。肼进攻肽键而不易与-COOH 反应，肼解中 Gln、Asn、Cys 被破坏。 还原法：用 LiBH4还原 C-末端氨基酸成氨基醇，肽水解后可分离、鉴定。 羧肽酶法：专一地从肽链 C-末端开始逐个降解释放出游离氨基酸，P171 图 4- 7。 （三）二硫键断裂： 用变性剂，如 8mol/L 尿素或 6mol/L 盐酸胍使蛋白质变性，分子内部-S-S-露 出，并用 HSCH2CH2OH 处理，则-S-S-变成 2 个-SH，再用碘乙醇保护-SH 不被氧化， P172 图 4-8。 也可用过甲酸氧化，将-S-S-变成 2 个磺酸基。 （四）氨基酸组成分析： 10 可用氨基酸分析仪进行测定。样品可用酸完全水解（6mol/L HCl） ，再用碱水 解测 Trp。 测出 Asx 和 Glx，酰胺基总量由水解液中 NH4Cl 量计算出。 P172 表 4-8 列出一些蛋白质的氨基酸组成。 （五）多肽链部分裂解成小肽段，分别测序： 现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段，需将蛋白质先裂解成较小肽段，分 离后测序。 （1） 酶裂解法：常用的蛋白酶有以下几种（为内切酶）： 胰蛋白酶：水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键，如 Lys，Arg。 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：肽键羧基端为芳香族氨基酸，如 Phe、Trp、 或 Tyr，以及疏水氨基酸 Leu、Met 或 His。 胃蛋白酶：特异性不太强，切点多，肽键羧基端为芳香族和疏水氨基酸。 （2） 化学裂解法：溴化氰 BrCN 断裂羧基端为 Met 的肽键，反应见 P175 图 4-10， 生成肽酰高丝氨酸。 （六）肽段氨基酸序列测定 （1） Edman 化学降解法： 每反应一次生成一个 PTH-AA，层析分离、鉴定，剩下减少一个残基的肽链， 又有新 N-端参加下一轮反应。由此进行氨基酸序列自动分析，进行几轮反应 就能测出几个残基序列。最低样品用量仅 5 pmol。 Edman 降解现已有多种改进。如 DNS-Edman 测序，可提高灵敏度；试剂的 改进，用由荧光基团或有色基团标记的 PITC 可更灵敏。 （2） 质谱法：电喷射电离（ESI） ，见 P178 图 4-11。使蛋白质离子解吸进入气相， 15 肽以下均可用。 （七）肽段在多肽链中次序确定 用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段，由于切口错位， 可由重迭肽（两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段）确定肽段先后次序，从而拼 凑出整个多肽链的氨基酸序列。P179 图 4-12。 （八）二硫桥位置的确定 用切点多的胃蛋白酶水解肽链，生成比较小的含二硫桥的肽段混合物，将样 品点在滤纸中央，在 pH6.5 进行第一向电泳分离。然后用过甲酸蒸气熏，-S-S- 氧化断裂成两个含磺酰丙氨酸（带负电荷）的肽。将滤纸转 900，在完全相同条 件下再进行第二向电泳，大多数肽段迁移率未变，位于滤纸对角线上，而含磺酰 丙氨酸的肽段由于负电荷增加偏离对角线（向正极向） ，见 P178 图 4-13。将每 对含磺酰丙氨酸的肽段分别取下，进行氨基酸序列分析，推出二硫桥的位置（肽 链内或肽链间） 。 现在越来越多的蛋白质氨基酸序列是由核酸的核苷酸顺序推定的，但仍需氨 基酸序列分析配合。 1.8 蛋白质的三维结构 P197 第 5 章 蛋白质三维结构由氨基酸序列决定，且符合热力学能量最低要求，与溶剂和环境有 关。 主链基团之间形成氢键。 暴露在溶剂中（水）的疏水基团最少。 多肽链 与环境水（必须水）形成氢键。 （一）研究蛋白质构象的方法 （1）X-射线衍射法：是目前最明确揭示蛋白质大多数原子空间位置的方法，为研究蛋 白质三维结构最主要的方法。 11 步骤为：蛋白质分离、提纯单晶培养晶体学初步鉴定衍生数据收 集结晶解析结构精修结构表达。 （2）其他方法：NMR、紫外差光谱、荧光和荧光偏振、圆二色性、二维结晶三维重构。 （二）稳定蛋白质三维结构的作用力 （1） 弱相互作用（或称非共价键，或次级键） 1. 氢键 2. 疏水作用（熵效应） 3. 范德华力 4. 离子键（盐键） （2） 共价二硫键 （三）酰胺平面和二面角 P 205 图 5-11 （1） 酰胺平面（肽平面）：肽键上的四个原子和相连的 C1和 C2所在的平面。 （2） 两面角：每个氨基酸有三个键参与多肽主链，一个肽键具有双键性质不易旋 转，另两个键一个为 C1与羰基形成的单键，可自由旋转，角度称为 ，另 一个为 NH 与 C2形成的单键也可自由旋转，角度称为 ， 和 称为二面 角或构象角，原则上可取-1800+1800之间任意值（实际受立体化学和热力学 因素所限制） ，肽链构象可用两面角 和 来描述，由 和 值可确定多 肽主链构象。 （四）二级结构 P207 多肽链折叠的规则方式，是能量平衡和熵效应的结果。主链折叠由氢键维持 （主要） ，疏水基团在分子内，亲水基团在分子表面。 常见的二级结构元件：-螺旋，-折叠片，-转角和无规卷曲。 （1） -helix：蛋白质含量最丰富的二级结构。 肽链主链围绕中心轴盘绕成螺旋状紧密卷曲的棒状结构，称为 -螺旋。 1. 两面角 和 分别在-570和-470附近（：从 C向 N 看，顺时针旋转为正， 逆时针为负；：从 C向羰基看，顺时针为正，逆时针为负。 ） 2. 每圈螺旋含约 3.6 个氨基酸残基，由 H 键封闭的环中原子数为 13，此种 -螺 旋又称 3.613-螺旋，每周螺距为 0.54nm，R 基均在螺旋外侧，P208 图 5-14。 3. -螺旋本身是一个偶极矩，N-末端带部分正电荷，C-末端积累部分负电荷； -螺旋几乎都是右手螺旋而有手性，并有旋光性，可用圆二色性（CD）光谱研 究。 4. 影响 -螺旋形成的因素：R 基小且不带电荷，易形成 -螺旋。 如 Poly Lys 在 PH7 时，R 基带正电荷，静电排斥，不易形成 -螺旋，但 若 PH=12，消除 R 基正电荷可形成 -螺旋。 Poly Ile 由于 R 基大，虽不带电也不易形成。 Pro 由于无酰胺 H，不能形成链内氢键，所以当 Pro 和羟脯氨酸存在时， -螺旋中断，产生一个结节。 （2） -折叠片：第二种常见的二级结构 两条或多条相当伸展的多肽链侧向通过氢键形成的折叠片状结构，如 P210 图 5-17。 肽链主链呈锯齿状，肽链长轴互相平行。 氢键：在不同的肽链间或同一肽链的不同肽段间形成，氢键与肽链长轴接 近垂直。 R 基：交替分布在片层平面两侧。 有两种类型：平行结构（相邻肽链同向）和反平行结构（相邻肽链反向） ，见 12 P210 图 5-18。 （3） -转角和 -凸起 -转角是球状蛋白的一种简单的二级结构元件。为第一个氨基酸残基的羰 基与第四个残基的 N-H 氢键键合，形成一紧密的环在肽链回折或弯曲时形成， 使多肽链出现 1800急剧回折，见 P211 图 5-19。 -转角处 Gly 和 Pro 出现几率很高。 -凸起：是在 -折叠股中额外插入一个残基，凸起股产生小弯曲（P212 图 5-20） ，可引起肽链方向稍有改变。 （4） 无规卷曲：泛指那些不能归入明确的二级结构的多肽区段，实际上不是完全无 规，而是像其他二级结构那样具有明确而稳定的结构。常构成酶的活性部位和 蛋白质的功能部位。 （五）超二级结构 若干相邻的二级结构单元彼此相互作用，形成种类不多、有规则的二级结构 组合或二级结构串，在多种蛋白质中充当三级结构的构件，如 P221 图 5-29 所示， 有 ， 等。 （六）结构域 多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成的三级结构（局部折叠区） ，是 相对独立的紧密球状实体，称为结构域或域，是球状蛋白质的独立折叠单位。 对于较小的球状蛋白质分子或亚基，结构域就是三级结构；对于较大的球状蛋白 之或亚基，其三级结构往往由两个或多个结构域缔合而成，为多结构域。 结构域形成再缔合成三级结构动力学更为合理，特定三维排布的结构域形成， 有利于结构域之间活性中心的形成，结构域之间的柔性肽链形成的铰链区有利于 活性中心与底物结合，以及别构中心结合调节物发生别构效应。 （七）球状蛋白质的三级结构 球状蛋白质三级结构具有明显的折叠层次： 二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构（多聚体） 。 分子是紧密球体或椭球状实体，所有原子体积占 7277%，空腔约 25%。疏水 侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面，球状蛋白是水溶性的。球状蛋 白表面上的疏水空穴常用于结合底物、效应物等配体，为行使生物功能的活性部 位。 （八）蛋白质折叠和结构预测 （1） 蛋白质变性：天然蛋白质分子受某些物理化学因素，如热、紫外线照射或酸、 碱、有机溶剂、变性基的影响生物活性丧失，溶解度降低及物理化学常数改变 的过程称为蛋白质变性。 蛋白质变性为分子中次级键破坏，天然构象解体，但变性不涉及共价键 （肽键和二硫键）的破裂，一级结构保持完好，只是物化性质和生化性质改变。 变性剂： 能与多肽主链竞争氢键，破坏二级结构，如尿素、盐酸胍等； 表面活性剂：破坏蛋白质疏水相互作用，使非极性基团暴露于介质水中，如 十二烷基硫酸钠。 变性是一个协调过程，在所加变性剂很窄的浓度范围内，或很窄的 pH 或温 度区间内突然发生。 （2） 氨基酸序列规定蛋白质的三维结构 13 核糖核酸酶的变性和复性试验： 牛胰核糖核酸酶，为 124 个氨基酸残基组成单链，包含四个二硫键。 变性：加 8mol/L 尿素或 6mol/L 盐酸胍和巯基乙醇（还原二硫键） ，酶变性， 紧密结构伸展成松散的无规卷曲构象。 复性：将尿素等变性剂和巯基乙醇用透析法除去，酶活性又可恢复，最后 达原活性的 95100%。P235 图 5-49。 加入极微量巯基乙醇，有助于二硫键重排，加速酶的复性。 复性：变性的蛋白质在一定条件下重建其天然构象恢复其生物活性。 蛋白质天然构聚处于能量最低状态，理论上变性是可逆的，但实际上由于复性 所需条件复杂，不易满足而常常遇到困难。 根据分子生物学一个中心原理：顺序规定构象，活性依靠结构，蛋白质结 构是可预测的。全新蛋白质设计和蛋白质工程更需要蛋白质结构预测。 （九）亚基缔合和四级结构 （1） 蛋白质四级结构涉及亚基种类和数目，以及亚基在整个分子中空间排布（对称 性） ，亚基的接触位点（结构互补）和作用力（主要是非共价相互作用） 。 大多数寡聚蛋白质分子亚基数目为偶数，亚基种类一般是 1 或 2 种。 （2） 四级结构缔合的驱动力：弱相互作用（氢键、疏水相互作用，范氏力，盐键） ， 有的亚基聚合还借助亚基之间的二硫桥，如抗体是由两条重键和两条轻链组成 的四聚体，二硫键将两条重链与轻链连接在一起，P276 图 6-29。 （3） 亚基缔合方式：亚基缔合主要是疏水相互作用，缔合专一性则由表面的极性基 团的氢键和离子键提供。 许多蛋白质借异种缔合（相同亚基，但相互作用表面不同） 。形成线性或螺 旋形的大聚合体，如病毒颗粒外壳，P248 图 5-56 显示人免疫缺陷病毒（HIV- I）的核壳由几百个外壳蛋白亚基组成。 （4） 四级结构对称性：是四级结构蛋白主要性质之一，有旋转对称轴，如二聚体， 四聚体。 （5） 四级缔合在结构和功能上具有优越性：可增强结构稳定性，提高遗传经济性和 效率，使编码所需 DNA 减少，可使催化基团汇集在一起；具有协同性和别构效 应。 别构效应：多亚基蛋白质一般具有多个结合部位，结合在蛋白质分子的特 定部位上的配体对该分子和其他部位所产生的影响（如改变亲和力或催化能力） 称为别构效应。 具有别构效应的蛋白质为别构蛋白质，酶称为别构酶，具有调节代谢的功 能。 1.9 蛋白质结构与功能的关系： P252，第六章 从厌氧生物转化为好氧生物是生物进化中的一大进步。脊椎动物中血红蛋白在血液 中起到载氧和输氧的作用，肌红蛋白在肌肉中起贮氧和氧在肌肉中分配的作用。 （一）肌红蛋白（Mb）的结构与功能 （1）三维结构：由一条多肽链和一个血红素辅基构成，相对分子量 16700，含 153 个氨基酸残基。分子中多肽链由 8 段 -螺旋组成，分子结构致密结实，带 亲水基团侧链的氨基酸分布在分子外表面，疏水氨基酸侧链几乎全埋在分子内部， 见 P253 图 6-1。 （2）辅基血红素：由二价铁和原卟啉组成，原卟啉由 4 个吡咯环组成，见 14 P254 图 6-2。 铁原子只有亚铁态的蛋白质才能结合氧。蛋白质提供疏水洞穴，固定血红素 基，保护血红素铁免遭氧化，为氧提供一个结合部位。结合氧只发生暂时电子重 排。 （二）血红蛋白(Hb)的结构与功能 （1）血红蛋白由 4 个多肽链（亚基）组成，如 22（成人血红蛋白 HbA） ，每 个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位，-链有 141 个残基，-链有 146 个残基，且 链、 链和 Mb 的三级结构都非常相似（P259 图 6-9） 。实际上对 于人的这三种多肽链分析发现只有 27 个的残基是共有的，这表明蛋白质高级结 构的保守性。只要功能相同（都与氧结合） ，高级结构就相似，有时甚至是唯一 的。 血红蛋白与肌红蛋白结构上最大不同在于血红蛋白有四级结构，是四聚体， ， 而肌红蛋白只有三级结构。因此血红蛋白运载氧能力增强，还能运载 H+和 CO2， 在氧分压变化不大范围内完成载氧和卸氧工作。且 Hb 为变构蛋白，可受环境中 其他分子，如 H+，CO2和 2，3-二磷酸甘油酸（BPG）的调节。 （2） 氧结合引起血红蛋白构象变化，氧合血红蛋白和去氧血红蛋白在四级结构上 有显著不同，发生构象变化。 氧与血红蛋白结合是协同进行的，具有正协同性同促效应，即一个氧分子与 Hb 结合，使同一 Hb 分子中其余空的氧结合部位对氧亲和力增加，再结合第二、 三、四个氧分子则比较容易。 （3） Hb 和 Mb 氧合曲线如 P262 图 6-14 所示。 P(O2)：氧分压，表示氧的浓度（氧浓度与氧分压成正比） 。 Y：氧饱和百分数，为被占氧合部位与氧合部位总数之比。 当 Y=0，所有氧合部位空着；Y=1，所有氧合部位被氧占据；Y=0.5，半载， 此时所需氧分压大小为对氧亲和力指标。 Mb 氧合曲线为双曲线；Hb 氧合曲线为 S 型曲线。 S 曲线分析： 肺区氧分压较高，P（O2）约为 100torr（空气中氧分压 76021%=160torr） ， Y=0.97，近于 1，载氧。 组织肌肉中需氧，P（O2）约为 20torr，Y=0.25，卸氧。 Y：氧饱和百分数变化；P（O2）：氧分压变化。 肺区和组织肌肉中氧分压变化：P（O2）=10020=80torr，Hb 氧饱和百分数 变化为，Y=0.970.25=0.72，表示有近 3/4 氧可从 Hb 上卸下。由此可知在 S 曲线上，即使 P（O2）变化不大（仅 80torr）,也有较多的氧卸下，输氧效率 较高，可完成输氧，P（O2）在 20100torr 范围变化，为 Hb 工作区；相比 Mb 的双曲线，P（O2）在 20100torr 范围变化，Y 只有 0.1，表示氧不易 卸下，只能担负贮氧功能。 Hb 与 Mb 功能差别只是因为 Hb 有四个亚基，有四级结构，可进行协同载氧 和卸氧工作，Mb 只能贮氧。 （4） H+，CO2和 BPG（2，3-二磷酸甘油酸）对血红蛋白结合氧的影响 ： 它们与 Hb 结合部位离血红素基甚远，是通过别构效应调节 Hb 与氧的结合。 1. 波尔效应（Bohr）： pH 降低（H+增加） ，CO2压力增加均降低血红蛋白对氧亲和力，促进血红蛋 15 白释放氧；反之高浓度氧又促使脱氧血红蛋白释放 H+和 CO2。 P264 图 6-17：pH 减少使 S 曲线右移，而 H+增加、CO2增加均使 pH 减少。 生理意义：在组织区 CO2产生，为高 CO2区，pH 约 7.2，有利于 Hb 释放氧， 载 CO2；在肺区氧吸入，pH 约 7.6，有利于 Hb 与氧结合，放出 CO2。 2. BPG 降低 Hb 对氧亲和力： BPG 可由糖代谢产生，正常人血液中约含 4.5mmol/L，约与血红蛋白等摩尔 数。 P265 图 6-19 显示出在不同 BPG 浓度下血红蛋白的氧合曲线，BPG 浓度增 加，Hb 氧合曲线右移。 无 BPG， Hb 氧合曲线为双曲线，不易卸氧； 当 BPG=4.5mmol/L 时（正常生理状况） ，为 S 型曲线，可卸氧，此时 P（O2）=26torr，Y=0.5； 当 BPG=7.5mmol/L 时（非正常生理状况如高山反应，及病理状况如肺气 肿） ，S 曲线右移，更易卸氧，满足肌体对氧需求，此时 P（O2）为 34torr，Y=0.5。 （三）血红蛋白分子病 人类已发现 300 多种不同突变的血红蛋白，许多突变是有害的，产生遗传病， 如镰刀状细胞贫血症： 病状：贫血症； 检查：血液中含大量镰刀形红细胞 HbS，没有足够可承担输氧的正常圆形细 胞 HbA。镰刀状细胞贫血病是血红蛋白分子突变引起的。 研究：电泳发现 HbS 和 HbA 电泳速度和等电点均有差异。在 pH8.6 下均向正 极移动，但 HbS 比 HbA 稍慢，说明 HbS 比 HbA 少几个带负电荷基团。 氨基酸测序发现 HbA 与 HbS 区别在于 -链上 6-位 Glu（HbA）变为 Val（HbS） ，结果由于疏水相互作用，-链上 6-Val 与 1-Val 接近，使血红蛋 白分子从扁平状压缩变形，形成细长聚集体红细胞，构成镰刀形，与氧结合力 降低。 值得注意的是血红蛋白分子四条肽链共 574 个氨基酸残基，只两个 -链上 的氨基酸被代替（2Glu2Val） ，即引起如此严重疾病。 1.10 蛋白质分离和纯化 P290 7 章 （一）蛋白质分子量测定： （1） 根据化学组成测最低分子量： 1. 肌红蛋白、血红蛋白均含铁 0.335%，分别求它们的最低分子量： 肌红蛋白为 55.8（Fe 原子量）0.335100=16700，与其他方法测分子量 相符。 血红蛋白含铁也是 0.335%，最低分子量也为 16700，但用其他方法测分子量 为 68000，即每一个血红蛋白含有 4 个铁原子，由此计算更为准确分子量为： 167004=66800。 2. 由氨基酸含量计算： 如牛血清清蛋白含 Trp0.58%，蛋白质最低分子量为 35200；每一牛血清蛋白 含有 2 个 Trp，所以分子量为 70400，比其他方法测出的准（69000） 。 （2） 沉降系数和沉降系数单位： 蛋白质分子在溶液中受强大离心力作用时，蛋白质分子沉降，沉降速度与蛋 白质分子大小和密度、分子形状等有关，可用于测分子量。 16 沉降系数：蛋白质颗粒在单位离心场的沉降速度是个定值，称为沉降系数或 沉降常数用 s 表示。 s 常用来近似描述生物大分子的大小，蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降 系数介于 110-13到 20010-13sec 范围，见 293 表 7-4。 为方便起见，把 10-13sec 作为一个单位,称为 svedberg（斯维得贝格）单位 或沉降系数单位，用 S 表示，如人的 Hb 沉降系数为 4.46S，即为 4.4610- 13sec。 （二）蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀： 蛋白质溶液属胶体系统，分散相质点大小 1100nm。 蛋白质可用盐析，有机溶剂沉淀，生成重金属盐、加生物碱和某些酸类（如三氯 乙酸）进行沉淀；蛋白质加热变性也会沉淀。 （三）蛋白质的分离纯化： （1）前处理：将蛋白质从动、植物或细菌的组织或细胞中以溶解状态释放出来， 并保持天然状态，不丢失生物活性，如用适当缓冲液提取蛋白质，离心除去杂质。 （2）粗分离：将蛋白质提取液中所需要的蛋白分出，除去其他杂蛋白、核酸和多 糖等。 1. 等电点沉淀和 pH 控制： 等电点沉淀：改变蛋白质溶液 pH，使蛋白质净电荷为零处于等电点，相邻蛋 白分子间无静电斥力，溶解度最低，蛋白保持天然构象聚集沉淀。 P305 图 7-10 pH 和离子强度对 -乳球蛋白溶解度的影响，等电点为 pH5.25.3，溶解度最低。 由于不同蛋白有不同等电点，也可将一些蛋白质混合物分开。 2. 盐溶和盐析： 盐析：当溶液中盐浓度增大，离子强度达一定数值时，蛋白质溶解度下降并 进一步析出。 盐析蛋白保持天然构象，能再溶解。一般用硫酸铵盐析，硫酸铵在水中溶解 度高，且溶解度的温度系数较低。 盐溶：当加入低浓度中性盐时，蛋白质溶解度增加。 （3） 细分级分离： 一般用层析法和电泳法。 1. 电泳：在外电场作用下，不处于等电状态的带电颗粒（如蛋白质分子） 将向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。 电泳迁移率或泳动度（）：为单位电场强度下，蛋白质分子在溶液中的移 动速度。 = /E ：颗粒泳动速度，E：电场强度 常用的电泳种类： 区带电泳：在支持物上电泳时，蛋白质混合物被分离成若干区带。 薄膜电泳：使用醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜。 凝胶电泳：凝胶有分子筛效应，可更好分离。如常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 。 毛细管电泳（HPCE）：毛细管散热好，有助于消除热引起的对流和区带变宽； 系统高分辨力，进样量少，可分离手性化合物。 17 等电聚焦电泳：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成 pH 梯 度，