白血病细胞克隆构建和增殖的遗传多样性1

白血病白血病干细胞和遗传表型图干细胞和遗传表型图的遗传多样性的遗传多样性 GeneticGenetic architecturearchitecture refers to the underlying genetic basis of a phenotypic trait. A synonymous term is the genotype-phenotype map, the way that genotypes map to the phenotypes. 近来有关癌细胞基因组的详细研究，揭示了其异常的复杂性, 每种细胞都呈现出大量 的驱动突变，中性突变或载体突变。尽管这些筛选都提供了很多信息，然而它们反映出的 综合性遗传全貌使得疾病亚克隆异源性的存在变得模糊起来。细胞内的遗传多样性是癌症 的普遍特点。亚克隆遗传复杂性也可能成为治疗目标的一个重要考虑因素。此外，如果一 组肿瘤干细胞-也就是我们所说的 propagating cell-是持续克隆扩增和疾病进展的基础， 它们就应该具有遗传多样性。 目前，为了确定细胞内的遗传表型图需要单个细胞或细胞集落的详细研究较少，尽管 如此，它们还是有利的证明了明显异源性的重要性。我们选择了急性淋巴细胞白血病组织 作为研究对象, 是基于其便于单细胞分析、很少被干扰或是不稳定，以及已知的遗传事件 的时间序列。具有 ETV6-RUNX1 融合基因的 ALL 的 B 细胞前体，后来发生的突变很可能 是产前做定的起始事件。它与适当数量的 CAN（CNV）alterations of the DNA of a genome that results in the cell having an abnormal number of copies of one or more sections of the DNA 相偶联。这些二次突变，很可能在出生后发生的基因畸变，调整了细胞周期即 B 细胞的分 化。 ALL 基因型的亚克隆多样性基因型的亚克隆多样性 我们开始选择了 60 例 ETV6-RUNX1 阳性的 ALL 患者（其突变亦用 FISH 检出， 15%85%的细胞） 。其中，30 例 至少有 10%的细胞有 PAX5 （n=15）或 CDKN2A（p16） （n=12）缺失或者两者都缺失的情况（n=3） 。所有 30 例标本用了 BAC 探针做了更进一步 的分析。每例 200 个具有 ETV6-RUNX1 融合基因的细胞被评估，每一单个细胞设计呈一 个等位基因状态，对 ETV6 PAX5（三色） ETV6 CDKN2A（三色） ETV6 PAX5 CDKN2A（四色） 。ETV6-RUNX1 探针也可检测融合基因的复制（15）21q 的额外拷贝。 后者是急淋中一个普遍的遗传异常和推测的驱动事件。用于记录遗传上有区别的亚克隆的 截止水平，用正常作为对照的血样，由探针的结合情况设定变异区间。含单个 CAN 的细 胞以 2%作为阈值，含两个以上 CAN 以 1%作为阈值 （TABLE2） ETV6-RUNX1 是所有白血病细胞普遍的标志，根据 ETV6-RUNX1 点计单个细胞，可 以用来确定亚克隆不同的遗传学特征和它们出现的相关频率。由此，我们可以推断出这些 亚克隆和衍生克隆遗传表型图的最可能的进化关系。 已知的遗传表型图具有多样性。我们证实的最简单的（6 例）含有 2 或 3 个亚克隆， 可以被排成线性关系。 （Fig.1a）然而，这些例子具有最少的 CNA 互补链。 其余 24 例具有更多的标记性的亚克隆异源性，从一个祖先树分出 10 个亚克隆 （Fig1b，c） Figure1a-c 说明了观察到的遗传表型图（其他见 fig 2） 克隆基因型的研究揭示了一些尚未被认识的特性。显然，高周期性的 CAN 并未占据 优先序列，说明它们作为原癌基因的潜能与其他 CAN 相比并不是偶然的。具有最大数目 CNA 的亚克隆，位于分支图的末端，不一定在数值上占优势。令人意想不到的是，包含相 同基因的 CAN 可以同时出现于两个分别的亚克隆中，且不止发生过一次。EYV6 被独立检 测到 2-3 次 （fig1b.c） （14 in30） ；PAX5 （8 in 18）检测到 2-3 次(fig.1c)和 CDKN2A 被 检测到两次（4 in15） 。这些提出了一些有趣的机制问题，提示这些病变不仅发生在 clonal advantage，而且在针对 DNA 水平的破坏。一种可能的机制是通过 RAGS 或者 AID 的 off-target 效应。 这这种种重重排排在在儿儿童童期期 B-ALL 病病例例中中最最普普通通，使使用用 FISH 技技术术检检测测到到大大约约 21%病病例例中中都都 有有。Cytocell 的的 FISH 探探针针是是双双色色双双融融合合探探针针，阳阳性性细细胞胞有有两两个个黄黄色色信信号号。 ETV6 (TEL)探探针针包包含含一一支支含含 ETV6 5终终点点的的探探针针和和一一支支覆覆盖盖基基因因 3区区的的探探针针，都都标标记记为为红红 色色。对对于于 AML，两两支支探探针针都都标标记记为为绿绿色色，一一支支位位于于RUNX1 3，另另一一支支在在基基因因的的 5 末末端端。t(12:21)的的病病人人，除除了了相相应应的的 12 和和 21 号号正正常常染染色色体体的的红红色色和和绿绿色色信信号号，会会有有两两 个个（黄黄色色）融融合合信信号号 (1R，1G，2Y)。有有 ETV6 有有大大量量缺缺失失的的地地方方， t(12;21)缺缺失失的的信信 号号是是 1R、2G；或或者者是是，存存在在 t(12;21)重重排排的的信信号号是是 1Y、1G。 免疫表型和遗传学多态性免疫表型和遗传学多态性 已有 ALL-B 系早期分化系列抗原表达的表面标记， 且已有体内试验表明不同抗体标记的 白血病有不同类型的干细胞。我们通过 CD34（不成熟细胞）和 CD20（成熟 B 系抗原）的 表达分析细胞的遗传异质性。分类的细胞群体有着相似的复杂遗传表型图 （supplementFig3） CD34+CD38-CD19+ 只限于 ALL 表达。 我们发现 前 B 干细胞群 可能未被激活（38-）,其在 NOD/SCID 小鼠的 ALL 干细胞 中被检测到有丰富的含量。经过细胞分选后，含有与大部分白血病细胞群相似的遗传学特 性（supplementFig3） ALL 的动态遗传表型图的动态遗传表型图 这些 ALL 亚克隆遗传图是在某一特殊时间点-即在诊断的时候-被快速捕捉下来的。事实 上亚克隆多样性和亚克隆的相对优势随着疾病的进展是不断变化的。ALL 几乎没有相同的 发病前驱症状，但是偶尔（2%）有一些病人在诊断白血病的前几个月有不完全性的前白血 病状态。已确诊的急淋细胞有 ETV6-RUNX1 融合但是没有 ETV6 检测到。单核苷酸多态 性系列筛选检测到了多个位点 baokuoBTG1 11q 和 X-染色体，我们比较了病人两个时段的 细胞基因型，间隔 7 个月，观测到了一个标志性的拐点（Fig.2a）这些控制前期状态的亚克 隆，变成了控制白血病期的小部分的中间状态。检测到 CDKN2A 的干细胞占优势。第二 个诊断 ALL 的病人前三个月有前驱症状，同样就业检测到了亚克隆拐点。 （supplementaryfig.4） 用单基因探针或 SNP 序列检测的治疗和复发的 ALL 回顾者的异常遗传谱反应了作为 复发标志的区分性亚克隆的选择。对入选的 30 例患者中的 5 个（6,9,28,29,30）我们用可靠 的复合 FISH 探针将诊断和复发的细胞匹配起来。复发的细胞其遗传表形图与诊断是是不 相同的。相对性的亚克隆遗传图谱有助于我们鉴别最可能导致复发的亚克隆，尽管还有些 不清晰（Fig.2b 和 Supplementary Fig2）复发灶可能来源于之前诊断的主要或者是次要的 克隆但而且不止一个。 （patient 6 和 30 Supplementary Fig2）这些数据也说明了复发占据优 势的克隆仍然具有多样性，一些情况下，同一基因或染色体同一区域的获得性遗传病变， 在最初诊断时的克隆中被发现。这与之前在复发中观察到的有区别的 ETV6 缺失，为重叠 的 CAN 提供了证据。在复发克隆中观察到的遗传多样性提示了基因不同的白血病干细胞 能在化疗后生存，为复发和以后的多样性提供了储存库。 急淋干细胞的遗传多样性急淋干细胞的遗传多样性 由急淋的遗传表现图，不能认为所有经证实的亚克隆都是独立生存和依靠自我更新能 力进行繁殖的。在种系进化中，一些分支或者亚克隆长时间生存不管其他的死了或是失去 了竞争能力。无论如何，这些遗传表型图表明 ALL 的干细胞具有富于变化的遗传性，还待 通过移植免疫缺陷的小鼠中证实。我们经胫骨内移植细胞数(2*103-106)的经流式分选的 白血病细胞到预放射的 NOD/SCID IL2R-r null小鼠体内。扩增的白血病细胞群再次移植到受 体小鼠内作为自我更新能力的验证。我们通过成功的体外传代，从第一次和第二次的移植 物，同开始诊断的标本，比较了细胞的遗传学特征。经移植获得 ALL 的小鼠的骨髓和脾脏 中占有较大比例（3.1 到 93.5，平均 59.4，supplementary Table 3 和 4）的人造血干细胞 （CD45+） 。 （supplementary Fig5b，c）所有人 CD45+ 细胞都有 ETV6-RUNX1 融合基因 （supplementary Fig5d） 。从骨髓、脾脏中获得的细胞经过同样的遗传学分析得到相同的结 果。 （supplementary Table4） 。 体外白血病重建在未分选和分选的细胞群中（CD34+CD38-CD19+） （CD38+）观察 的一致（supplementary Table3，4）这些结果和之前 ALL-B 细胞前体干细胞的证据表明它 们不仅仅是一种免疫表型。 所有的 24 只初次或二次移植的小鼠中一些基因型不同的亚克隆出现，反应了起病时诊 断的样本的亚克隆多态性。 （Fig3 和 4 supplementary Table3，4） 。再次移植的白血病细胞 与移植前的相比,出现了高分辨率的 SNP 序列。基于 3 号患者，这些数据证实了 CDKN2A 亚克隆的缺失，21 号染色体亚克隆的获得，以及 ETV 同时存在于诊断和复发的标本中的 一个拷贝的缺失。 复发的白血病色遗传图表明遗传性不同的亚克隆的潜能不同。对于 3 号患者（Fig.3 and Supplementary Table 3）,从初次和再次移植物读取的 4 个亚克隆中有三个是共显性的。 之前被推测是前白血病的克隆（只有 ETV6-RUNX1 融合基因）并未复发。来自 7 号患者 未分选的细胞（Fig.4 and Supplementary Table 4）,6 个来自再次移植的亚克隆中 4 个复发。 这些中有一个占据优势（Subclone F in Fig.4） ，尽管其在初始诊断的样本中只占很少的比例 （11%） 。 SNP 序列用来比较初始诊断的白血病和移植复发的白血病。这些提示除了 CAN in CDKN2A，ETV6 和 21 号染色体外，白血病细胞也有 BTLA 和 BTG1 的缺失（Fig.4d） 。复 发的白血病有一条增加的 22 号染色体，而在最初诊断时的细胞群中似乎是没有的。 （Fig.4d）这在用 22 号染色体 BAC 的 FISH 探针得到进一步的证实。确实了大多数复发 的白血病细胞的 SNP 序列（三个 RUNX1 和 1 个 ETV6 信号）有额外的 22 号染色体信号 （Supplementary Fig7. 4） 。 在初始诊断的细胞中没有检测出有额外的 22 号染色体信号。然而，因为在所有植入相同细 胞的 9 只小鼠中 F 克隆都占优势，我们假设 F 克隆的一小部分有额外 22 号染色体的亚克 隆 在诊断时出现不过小于 1%的频率。亚克隆复发的可变潜能在注射分选细胞的小鼠中也 观察到。 （Supplementary Table 4 and Supplementary Figs7,8） 这些数据提示了亚克隆遗传多态性和干细胞的复杂性，同时，可变的有竞争力的复发 模型体外试验也指出了不同的基因型是在功能上彼此联系的。 讨论：讨论： 肿瘤在细胞水平的发展被认为符合达尔文的自由选择学说。所有的细胞在一个复杂的 微环境里。细胞突变和表型的多态性是这个过程的基础。驱动突变在细胞自我更新时具有 最大的选择精确性。 肿瘤亚克隆遗传多态性的证据已被染色体核型、多的遗传性分析，用 FISH 进行的组 织片段的筛选，或者是免疫分选细胞，微小组织活检分子探针，显微解剖组织，以及最近 的遗传多倍体分析。个体循环肿瘤细胞的遗传表型图也在研究中。这些研究证实亚克隆的 遗传异质性是一个普遍存在的事实，克隆多样性的程度预示着疾病的进展。大部分数据来 自上皮肿瘤的复杂遗传图与遗传的不稳定性。这些情况中，驱动突变事件的时间和顺序被 有效的隐藏了，除非显性克隆的出现。 一个普遍的假设认为，肿瘤和白血病，起源于 ref.22 进化模型，疾病的进展和主要的遗 传图反应了有序的显性克隆和线性动态分支图。我们的数据（supplementaryFig1）表明亚 克隆发展的动态图形和祖系关系，后者并不是线性而是可变的。其他肿瘤的遗传多样性的 图用分选的单或多倍体细胞用比较基因组杂交技术得到的致瘤的微小卫星标记，或长序列 的 IGH 基因重排，说明了非线性的克隆轨迹。 我们测到的亚克隆的遗传可变性可能被忽视了。我们筛选了有限数量的预定 CAN， 就是说其他的与依照顺序的驱动突变叠加出现的 CAN 之前并没有记录。我们将频率在 1%2%以下的祖系亚克隆设定为阈值，与（see Supplementary Fig2 patients 2,5,15,18,20,6） 。 确定 ALL 亚克隆遗传表型图，要求单细胞水平的整基因组分析。 我们的数据提供了个体患者的肿瘤干细胞的遗传多样性的第一手资料。再植小鼠亚克 隆的一致性图谱显示内在的可变潜能与干细胞不同的基因型是相互关联的。观察到的一些 特殊的亚克隆的竞争潜能，可能在一定程度上反应了选择压力运用于某一成熟的组织环境。 患者的自然克隆选择可能产生不同的效果。 评估干细胞的遗传多样性对一般的肿瘤和白血病是否适用是非常重要的。如果是，对 于肿瘤干细胞本身和这种细胞的靶向治疗作用将具有显著的适用性。起初不同的分级的的 干细胞亚群的模型在 ALL 和其他肿瘤中都具有争议性。NOD/SCID 体外试验获取的人肿瘤 干细胞，简单的显出了一些显性克隆。或者，肿瘤干细胞是存在的，但是经过一段时间的 进化。我们之前存档了一些 ETV6-RUNX1-（+）ALL 的前白血病和显性白血病的干细胞， IgH 重排和表型不同。我们目前的数据很合适肿瘤干细胞的达尔文模型和以此产生的克隆 遗传表型图。具有自我更新特性的细胞具有驳杂的基因型，提供了进化多样性和疾病进展 选择的基本单位。尽管已被估计，肿瘤干细胞的遗