研究生实验设计

研究生分子生物学实验设计研究生分子生物学实验设计 概述 异基因造血干细胞移植是白血病治疗主要方法之一，复发和移植物抗宿主 病（graft-versus-host disease GVHD）是阻碍其发展主要原因。异基因干细胞移 植后复发的机制之一就是宿主对供者的局限性次要组织相容性抗原（minor histocompatibility antigens，mHags）产生耐受。日本方面的研究发现，统计标 危组 mHags 不相容复发率为 22，12 年生存率为 88%；全相容复发率则高达 66，12 年生存率也为 66。此结果提示，mHags 与复发密切相关。 mHags 分子表达于何种组织直接决定其诱导的免疫效应，HA-3、4、6、7 及 HA-Y 广泛性表达于各种细胞，同时参与移植物抗白血病(graft-versus-leukemia GVL)与移植物抗宿主病（graft-versus-host disease GVHD） ，而 HA- 1、2、5，HB-1，仅局限性表达于造血起源细胞，不产生或产生轻度 GVHD， 以诱导 GVL 效应为主，是分离 GVL 和 GVHD 的理想靶抗原。HA-1，2 均是 HLA-A2 限制性 mHAg，且均不与 HLA 连锁，只在造血细胞起源的细胞(如:纯 化的 T-细胞,B-细胞,单核细胞及未成熟的胸腺细胞)表面发现，在上皮起源的纤 维母细胞,角质形成细胞,黑色素细胞以及内皮细胞等细胞表面则不能检测到。 HA-1 由常染色体基因 KIAA0223 基因(HA-1R 编码 VLRDDLLEA)和其等位基 因(HA-1H 编码 HVLHDDLLEA)编码. HA-2 基因序列与肌浆球蛋白类基因的 序列有同源性。Koosterboer4研究显示接受 DLI 治疗的白血病患者 CTLs 的 335为 HA-1/HA-2 特异性 CTL，此克隆在总的白血病反应性 T 细胞中表现 出免疫优势。Etto1从大肠杆菌中重组 HA-1H 蛋白（一种 mHag） ，刺激 HA-1H 阴性供者外周血单个核细胞，产生特异性杀伤 HA-1H 阳性白血病细胞的 CTL。诸多研究表明，以 mHags 为靶抗原的免疫治疗可有效杀伤白血病细胞2,3。 本研究在既往研究的基础上以造血起源细胞的 mHags （HA-1，2）作为疫 苗靶标，建立重组 DNA，以免疫白血病模型小鼠，检测是否有特异性杀伤白血 病细胞的细胞毒性 T 淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）产生，同时探 讨是否可激活体液免疫，诱导特异性抗体的产生。 文献文献 1)Etto TL, Stewart LA and Nguyen TH, et al.Expression and purification of the minor histocompatibility antigen, HA-1H generated in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2007 ,54(1):176-182 2)Griffioen M, van der Meijden ED and Slager EH, et al.Identification of phosphatidylinositol 4-kinase type II beta as HLA class II-restricted target in graft versus leukemia reactivity. Proc Natl Acad Sci U S A.2008，3 Epub ahead of print 3)Etto TL, Stewart LA and Muirhead J, et al. Kappa immunoglobulin light chain polymorphisms and survival after allogeneic transplantation for B-cell malignancies: a potential graft-vs-leukaemia target. Tissue Antigens. 2007,69(1):56-61 4)Kloosterboer FM, van Luxemburg-Heijs SA, van Soest RA, et al. Direct cloning of leukemia-reactive T cells from patients treated with donor lymphocyte infusion shows a relative dominance of hematopoiesis-restricted minor histocompatibility antigen HA-1 and HA-2 specific T cells. Leukemia. 2004,18(4):798-808 基本内容 使用一个载体，表达两个基因 一个报道基因（如 GFP） 一个 HA -1 基因 HA-1 上加入可用于纯化的外源性抗原表位(epitope， 如 FLAG 或 His-tag) 基本要求 开放性设计，没有统一方案 允许使用商业性试剂盒、载体 以四人为一组，以小组为单位，独立设计，独立完成 设计方案书面呈交 技术细节要有描述，不能过于笼统 奖励创意，鄙视抄袭 技术步骤 基因克隆 HA 基因需要融合一段 FLAG-或 His-epitope 基因表达载体（包括启动子）选择 导入 DNA 到细胞内 表达检测 考核 递交书面报告 2 页，其中摘要不超过 300 字。 打分 创新性（30%） 、 可行性（40%） 书面报告文字叙述（30%） 学术资源（学无止境，仅供参考） NCBI（/） PubMed Entrez Google、Google scho