抗生素压力下铜绿假单胞菌耐药机制变化的动态研究.pdf

中国抗生素杂志2 0 1 0 年9 月第3 5 卷第9 期 7 1 5 文章编号：1 0 0 1 - 8 6 8 9 ( 2 0 1 0 ) 0 9 0 7 1 5 0 6 抗生素压 力tn绿假单胞菌耐药机制变化的动态研究 郭仲辉1 黎毓光 卓超2 ( 1广州市番禺区人民医院， - t 5 1 1 4 0 0 ； 2广州医学院呼吸疾病国家重点实验室，广州 5 1 0 2 3 0 ) 摘要：目的探索抗生素压力下铜绿假单胞菌在患者呼吸道内耐药性的动态改变。方法 以同一患者不同时期下呼吸道分 离铜绿假单胞菌为对象，e t e s t 检测细菌对常用抗菌药物的敏感性；三维水解实验检测 目标菌的p 一 内酰胺酶表型特征；普通p c r 检 ij e s bl 、amp c、碳青霉烯水解酶、膜孔蛋 t op r d 2 等耐药基因；荧光定量r t - p c r检测细菌的amp c 1 op r d2 的表达情况。 结果 筛查n1 例因慢性阻塞性肺病急性发作( a ec o p d ) 患者3 次入院、下呼吸道分离的属同一克隆的9 株铜绿假单胞菌，药敏试 验提示细菌的药敏谱存在由单一耐药逐渐转化为泛耐药的模式。三维水解实验显示，5 株多重耐药株和泛耐药株高产amp c酶。 所有9 株菌 的a m p c # h o p r d 2 基 因都 为阳性 ，碳青霉烯水解酶均 为阴性 。荧光 定量r t - p c r检测，多重耐药株和泛 耐药株 的a m p c 因表达量是单一耐药株 的1 7 1 8 7 倍；亚胺培南耐药株的o p r d 2 表达量则是敏感株 的1 1 0 - 1 2 0 0 0 。结论 铜绿假单胞菌在治疗过 程中可获得耐药性，其a m p c 高表达 f j o p r d2 表达下降是导致细菌对亚胺培南、广谱头孢菌素( 含酶抑制剂) 耐药的主要原因。 关键 词：铜绿假单胞菌 ；a mp c 酶；o p r d 2 ；抗生素压力 中图分类号 ：r 3 7 8 文献标识码 ：a cha ng e o f a nt i mi c r o bi a l r e s i s t a nc e i n ps e u d o mo na s a e r u gi no s a u nde r t he a n t i bi o t i c pr e s s ur e gu o zh o n g h u i ， l i y u g u a n g a n d zh u o c h a o ( 1 p a n y u p e o p l e s ho s p i t a l o f g u a n g z h o u ， g u a n g z h o u 5 1 1 4 0 0 ； 2 s t a t e k e y l a b o r a t o r y o f r e s p i r a t o r y d i s e a s e s ， g u a n g z h o u 5 1 0 2 3 0 ) ab s t r a c t 0b j e e t i v e t o e x p l o r e t h e c h a n g e o f a n t i mi c r o b i a l r e s i s t a n c e o f c l i n i c a l i s o l a t e s o f e u d o mo n a s ae r u gi no s a i s ol a t e d f r om l owe r r e s pi r a t or y t r a c t of a ecopd pa t i e nt unde r t he a nt i bi o t i c p r e s s u r em e t ho ds the s t r a i ns o f p ae r u gi n o s a i s ol a t e d f r o m s p ut um s a m p l e s we r e c o l l e c t e d fro m t h e s a m e p a t i e nt wi t h di f f e r e n t h os pi t a l i z a t i o ne t e s t me t h o d wa s e mp l o ye d t o d e t e c t d r u g s e ns i t i vi t y thr e e di m e ns i o n a l t e s t wa s us e d t o i d e nt i f y t h e d i f f e r e n t k i n d s o f b l a c t a ma s e p r o d u c e d t h e s t r a i n s p cr me t h o d wa s p e r f o r me d t o d e t e c t es bls ， amp c， c a r ba pe n e ma s e g e n e s a n d o p r d2 g e n e th e e x p r e s s i o n o f t h e c h r o mo s o m a l ampc b e t a l a c t a ma s e s a n d o pr d2 g e ne s i n t h e s t r a i n s we r e a na l yz e d by r e a 1 t i me pcr re s ul t s n i ne i s ol a t e s i s o l a t e d fro m 3 t i me s i n ho s p i t a l i z a t i o n we r e a na l yz e d a f t e r i d e n t i fie d t o be o ne c l o n e th e a n t i m i c r o bi a l s us c e p t i bi l i t y o f n i ne i s ol a t e s d i s p l a y e d a n i n t e r e s t i n g e v o l u t i o n f r o m b e i n g s u s c e p t i b l e t o s o me e x a mi n e d d r u g s t o b e i n g r e s i s t a n t t o a l l e x a mi n e d d rug s hi g h p r o d u c t i o n o f ampc wa s d e t e c t e d b y t hr e e d i m e ns i o na l t e s t i n 5 m dr s t r a i ns ，a nd ov e r e x pr e s s i o n of a mpc g e n e we r e a l s o d e t e c t e d b y fl u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e i p cr i n 8 m dr s t r a i n s a n d t h e a mo u n t o f a mpc e x p r e s s i o n i s 1 7 -1 8 7 t i me s t h a n t h a t i n s p a ca r b a p e n e ma s e g e n e s we r e n t d e t e c t e d i n a l l t h e s t r a i n s 8 i s o l a t e s wi t h d i mi n i s h e d e x p r e s s i o n o f o p r d2 we r e i p m r e s i s t a n c e co n c l u s i o n hi g h e x p r e s s i o n o f a mp c a n d o p r d2 d i mi n i s h e d e x p r e s s i o n e me r g e d 收稿 日期 ：2 0 0 9 1 0 1 9 基金项 目：广州市番 禺区科学技术局科技攻关项 h( 2 0 0 7 一 z一 6 1 一 1 ) ；广州市科技局 重点攻 关项 ( 2 0 0 6 z 1 e 0 1 4 1 ) 作者简介 ：郭仲辉 ，男 ，生： 1 9 7 2 年1 o 月，副主任技师，g u o z h o n g h u i p y s i n a g o m。 通 讯作者 ：c h a o _s h e e p 2 6 3 n e t 7 l 6 抗生素压力下铜绿假单胞菌耐药机制变化的动态研究 郭仲辉等 i n t he t r e a t me n t o f ps e u d omon a s a e r u gi n o s a ，whi c h r e s ul t e d i n ba c t e r i a l r e s i s t a nc e t o i mi pe ne m ，b r o a d s p e c t r u m c e p h a l o s p o r i n ( i n c l u d i n g e n z y me i n h i b i t o r s ) ke y w o r d s p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ； amp c p l a c t a ma s e ； o p r d2 ； a n t i b i o t i c p r e s s u r e 铜绿假单胞菌是最常见 的院 内感染致病菌 ，在 呼吸道感染中尤为常见。由于铜绿假 单胞菌具备固 有 耐药和获得性耐药两种方式 ，临床 上常表现为多 重耐药和泛耐药 ，使临床面 临严峻挑 战。相关文献 显示 ，铜绿假单胞菌在抗 生素选择压 力下获得的耐 药，对临床危害更严重 ，常使传统的抗菌治疗方案 难于应对。为此 ，本研究通过临床筛选 ，得到同一 患者在不同时期下呼吸道分离的、耐药表型发生变 化 的铜绿假单胞菌，用分子生物 学方法 ，调查其 常 见耐药机制 的动态变化 ，探讨临床如何合理选用抗 菌药物，达到在杀灭细菌 的同时又避免耐药性发生 的 目的，为经验性初始治疗铜绿假单胞菌感染提供 实验依据。 1 材料和方法 1 1 菌株来源和临床情况 目标菌来源于本 院呼吸科收治 患者黎xx，7 2 岁，因慢性阻塞性肺病急性发作( a e c o p d) 伴发肺部 感染，分别于2 0 0 8 年1 月 、2 0 0 9 年2 月 h 2 0 0 9 年7 月3 次入院。从下呼吸道共获得合格痰标本并培养 出铜 绿假单胞菌1 1 次，细菌经a p i 系统鉴定确认，分别将 1 1 次分离菌株命名为p al ，p a2 ，p a3 ，p al 1 。 患者分离出铜绿假单胞菌前7 2 h 内均接受过第三代头 孢菌素、碳青霉烯药物和喹诺酮类药物治疗 。标准 参考株为铜绿假单胞菌a t c c 2 7 8 5 3 。 1 2 细菌分子 同源性检测 采 用 肠 杆 菌 科 问 的 重 复 序 列 p c r( e ri c p c r) 检 测 菌 株 同 源 性 。 e r i c引 物 为 5 a agt a agt ga ct ggg gt g agc g一 3 。p c r反应 条 件 ：9 5 预变性4 mi n ，然后9 5 3 0 s ，4 2 3 0 s ， 7 2 6 0 s ，共循环2 4 次，最后7 2 延 0 7 mi n 。p c r产 物电泳后，图象应用b i o nu me r i c s 4 6 1 软件对图像进 行分析，聚类图类型，选择up g ma ( u n we i g h t e d p a i r g r o u p me t h o d u s i n g a r i t h me t i c a v e r a g e s ) 方法，条带位 置差异容许度选择1 0 ，优化值选择1 0 ，凡相似 度 的值大于8 0 者代表同一克隆株 ，小于8 0 者为不 同的基因型，代表不同的克隆株。剔 除与主克隆株 不同源的菌株( 新外源性感染) ，取属同一克隆的菌株 进入下一步实验 。 1 3 药物敏感性试验 用e t e s t 检测 目标菌对常用抗菌药物 的最低抑菌 浓度( mi c ) 。药物试条包括 ：哌拉西林、头孢哌酮 舒巴坦， 哌拉西林 z唑 巴坦、亚胺培南、美罗培南、 头孢 哌酮 、头孢他 啶、头孢吡肟 、氨 曲南、环丙沙 星、左氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星 、复方磺胺 甲嗯唑。e 试条浓度范围为：0 0 1 6 2 5 6 u g ml 菌株 药敏试验结果按c l s i 2 0 0 8 版标准判读【 1 。 1 4 b 内酰胺酶检测 用改 良三维水解实验 2 检测 目标菌的b 一 内酰胺酶 表型特征。 1 5 细菌耐药基 因的检测 采用普通p c r方法检测对碳青霉烯水解作用 的p 内酰胺酶耐药基 因( 6 g e s 、6 k p c 、6 s p m 、6 、 ， i m 、 6 m 、6 。 。 m 基因) 和 2 基因，采用多重p c r的方 法检noxa型基 因和质粒携带 的amp c 酶基 因，用 荧光定量r t - p c r方法检测op r d2 蛋白基因* d amp c酶 基因的表达量情况。耐药基因引物序列见表2 。 1 6 整合子的鉴定与分析 根据 文献 ，设计能 同时检测 i 类 、 i i 类和i i i 类 整合酶基 因的兼并引物 ，了解 目标菌所携整合子类 型 。整合酶 阳性菌株用普通p cr 扩增检测整合子的 q a c e 1 s u l l 基因和整合子可变区的耐药基因盒，并 对整合子可变区扩增产物进行测序及序列分析。检 测引物序列见表1 。 2 结 果 2 1 菌株的临床信息和分子同源性 由表2 可见，在3 次入院收集 的1 1 株 中，除第一 次和第二次入院分离 的2 株菌为新发感染外 ，其余9 株菌都为 同一克隆株 ，其中4 株分离前7 2 h 使用碳青 霉烯药物 ，4 株使用第三代头孢菌素加酶抑制剂复合 物( 含2 株联合喹诺酮类) ，1 株使用第四代头孢菌素。 2 2 待测菌株药敏试验结果 测 定9 株 属 同一克 隆菌对 1 4 种抗 菌药物的敏感 性，结果见表3 。由表3 可见，从第一次分离p al ，到 最后p al 1 ，同一克隆菌株的药敏谱的变化趋势为： 单一耐药( 以青霉素类和三代头孢菌素) 到多重耐药 f 三代头孢菌素 、碳青霉烯类和喹诺酮类) ，最后为泛 耐药( 仅阿米卡星敏感1 ，该过程尤以第二次入院表现 明 显。 中国抗生素杂2 o l o 年9 月第3 5 卷第9 期 7 1 7 肠 m b as h v b l a g e s a mpc ( c h r o mo s o ma l e n c o d e d ) a mpc pl a s mi d m e d i a t e d 6 ， k p c b a s p m b a v i m 6 m ， b a g im b a d 2 i nt e g r a s e q a c e x 1 - s u l l m u l t i p l e x pcr e x p e r i m e n t s b a o x a 23 一 l l k e b a 0 x a 24 1 l k e b a 0 x a一58 1 l k e b a o x a51 1 1 k e re a l t i me r t - pcr e x pe r i me n t s r po d a mpc o pr d2 aggaagagt atgattcaaca ctcgt cgt ttgg1 ltggc tgcgcaagctgctgaccagc t t a gc g( t c ) t gc c agt gc tc ga fo r cgt cgatccccaaggagaga re v gctgcctcgagaaccgtcat atgcagccaacgacaaagg cgccctcgcgagcgcgcttc dham f aactttcacaggt gtgctgggt dham r ccgtacgcat actggctt tgc f o r tgtcactgt at cgccgtc re v ctcagtgctctacagaaaacc f o r cctacaat ct aacggcgacc re v tcgccgtgtccaggtat a ac f o r gtc1 atttgaccgcgtc re v ctactcaacgactgagcg f o r atgagcaagtta tctg1 ： a ttc re v tt agttgcttggttttgar g f o r t tgccagct ttagctcagggtc re v ta a tcagccgacgcttcagcgg fo r gcgcat ctccaagaccatg re v gccacgcgarr tgacggag fo r tgcgggtya argat btkgattt re v carcacatgcgtrtar a t fo r atcgca a tagttggcgaagt re v gcaaggcggaaacccgcgcc f o rga t cgg at t gga gaa cca ga re vatt t ctgac cgc att t cc at f o r ggt tag t tg gcc ccc ttaaa re vagttga gcg aaa agg gga tt fo r aag ta t tgg ggc ttg tgc tg re vccc ctc tgc gct c1 a cat ac fo r 1 aa t gc ttt gatcgg ccttg re vtgg attgca ctt cat crrgg f o r acctgccggagga=r a tttcc re v gggctgtctcgaat acgttga f o r cgccg1 acaaccggtgat re v cga f o r ctacggct acggcgaggat re v gaccggact ggaccacgtact 5 3 5 3 0 5 2 2 5 l 2 4 3 4 0 5 l 0l o 6 4 9 7 7 4 7 41 7l 3 1 9 3 4 9 1 7 98 5 01 2 4 6 5 9 9 3 5 3 8 9 l 1 4 3 3 4 】 【 3 】 3 3 】 3 3 】 3 5 5 3 6 7 1 8 抗生素压力下铜绿假单胞菌耐药机制变化的动态研究 郭仲辉等 表2 受试铜绿假单胞菌分离的临床信息情况 t a b 2 t h e c l i n i c a l i n f o r ma t i o n a n a l y s i s o f t h e i s o l a t e d ps e u do mo na s ae r u gi no s a 菌株编号 分离时 间 分离前7 2 h 内使用的抗菌药物e r i c p c r分型 2 3 d 内酰胺酶的检测 用ni t r o c e fi n 检i lj 9 株菌 ，均产b 内酰胺酶。三维 试验显示，p a5 、p a6 、p a8 、p a 9 、p a1 0 、p a1 1在 氯唑西林单独加入时抑酶试验为阳性 ，即该6 株菌产 a mp c 酶( 图1 a) 。除p a5 p b ，其余5 株菌同时加入c l o i j c l a时抑酶试验为阳性 ，说 明该菌同时产生a mp c n e s b l s 两种酶， j s s b l 检测 阳性( 图1 b ) 。所有亚胺 培南耐药株酶提取液加入e dt a后，抑酶试验为阴 性，即不产金属b 一 内酰胺酶 。 2 4 耐药基 因的检测 普通p c r检测9 株 的13 内酰胺酶相 关耐药基因显 示，所有菌株t e m 1 和ox a一 1 0 酶基 因均为阳性 。所 有菌株染色 体介导的amp c酶基因均为阳性，测序 表3 1 l 株 菌对 1 4 种抗菌药物 的敏感 n ! ( mi c g g ml ) t a b 3 t h e s e n s i t i v i t y o f t h e e l e v e n s t r a i n s t o t h e f o u r t e e n a n t i b i o t i c s ( mi c g g ml ) 结果与铜绿假单胞菌工程菌p ao1 的a m p c 全基 因( 基 因登陆号ae 0 0 4 0 9 1 ) 完全 同源 。所有菌株未检测到 碳青霉烯水解 酶耐药基 因( 6 g s 、b l a k p c 、b l a s p m 、 b l a v i m 、b l a i m p 、b l a g i m 基因) 。此外 ，9 株菌0 p 2 基因 均为阳性，整合子整合酶基l n( i n t e g r a s e ) 均为阴性 。 2 5 耐药基因表达的情况 用荧光定量r t - p c r检测 了9 株菌的a m p c的表达 d o p r d2 基因情况 ，结果表 明，p a5 、p a6 、p a8 、 p a 9、p al 0a mp c 酶基因表达量升高，p a 2 、p a5 、 p a 6 、p a 8 、p a 9 、p a1 1 的o p r d 2 基因表达减弱。荧 光p c r n ij 定结果与菌株药敏结果的对应比对见表4 。 3 讨论 铜绿假单胞菌主要有4 种耐药机制：产生抗生 素灭活酶或修饰酶；通过 改变抗菌药物作用的靶 位 ，以逃避抗菌药物的抗菌作用 ； 膜屏 障与主动 外排作用 ，限制药物到达其作用靶位 ；形成生物 膜 ，使抗菌药物不能有效地到达作用 部位 。其 中， 产b 内酰胺酶和膜孔蛋 白op r d2 缺失或表达减弱 是 中国抗 生素杂志2 0 1 0 年9 月第3 5 卷第9 期 7 l 9 a： c l a阳性，产amp c酶；b： c l 0和c l a双阳性 ，同时产es b l 和 amp c酶；c l o：氯唑西林；c l a： 克拉维酸 。与cl o或 ij cl a协 同 的纸片为头孢 曲松 ，与e dt a协同的纸片为亚胺培 南。 图1 三维试验检测b 内酰胺酶表型 f i g 1 t h e 13 - l a c t a ma s e t y p e t e s t e d b y t h e t h r e e d i me n s i o n a l t e s t 表4 受试铜绿假单胞菌分离的临床信息情况 t a b 4 t h e c l i n i c a l i n f o r ma t i o n a n a l y s i s o f t h e i s o l a t e d p s e u d o mo n a s a e r u g i n o s a 对碳青霉烯和第三代 头孢菌素 的主要耐药机制 。研 究表明，这两种耐药机制 多在抗生素治疗过程 中获 得，或者相应基因表达发生改变而出现继发耐药 。 因此 ，本研究针对这个特 点，观察了一株长期定植 感染于患者下呼吸道 的铜绿假单胞 菌的相关耐药性 动态变化。 结 果表 明，该铜绿 假单胞菌克 隆株在患者3 次 入 院过程中，耐药表型经历了由相对单一耐药向多 重耐药、泛耐药模式的转化 。而该过程的发生与细 菌amp c 酶产量和op r d 2 缺失或表达减弱密切相关。 首先从p 内酰胺酶的检测结果看，9 株菌中仅p a5 、 p a6 、p a8 、p a9 、p al 0 ，p al 1 测得amp c酶阳性 。 由于amp c 酶可 以水解第三代头孢菌素，酶活性不能 被酶抑制剂( 舒巴坦、三唑巴坦) 抑制，因此菌株对哌 拉西林 三唑巴坦、头孢哌酮 舒 巴坦耐药。而且由于 p a6 、p a8 、p a9 、p al 0 ，p al 1 还产e s b l s ，使菌株 对头孢吡肟耐药。 文献报道，铜绿假单胞菌染色体固有携带a m p c 基 因，但基因的表 达受诱导剂f 抗生素) 调节，促使 amp c 酶的产生 ，一旦去除抗生素 ，大多数情况下产 酶水平水逐渐恢复到基线水平【 s 。但当a m pc 基因 自 发突变可致稳 定的去 阻遏表达而产生持续性的高水 平酶 。 由于这个机制的存在 ，本研究所有9 株菌都 携带a m pc 基因 ，初始分离 时( p a1 ) 由于未受到青霉 素或三代头孢菌素的压力 ，因此对哌拉西林 三唑 巴 坦 、头孢哌酮 舒 巴坦都敏感 ，三维试验也无法检测 到，而且荧光r t - p c r 也提示， c 呈低水平表达。 但随着抗菌治疗的开始，amp c酶呈诱导性高表达， 与荧光r t - p cr结果一致f 是初始表达量的 1 7 1 8 7 倍) ，而且在4 个月后到第三次入 院时，虽然该期问 未接受广谱抗生素治疗，但三维试验和荧光r t - p c r 仍提示p a1 0 和p a1 1 的a m pc呈 高水 平表达 ，推测 a m p c 基 因已出现去阻遏表达，下一步研究将对此进 行 确证 。 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要是 由于o p r d2 含量减少甚至丢失引起外膜通透性下降所 致 1 0 - 1 1 】 ；也有研究认为单纯o p r d2 基 因缺失仅表现对 i mp 低水平耐药，它总是和其他 因素一起作用才对碳 青霉烯类抗 生素产生明显 耐药性 ，产生染色体介导 的amp c 酶，合并孔蛋 白op r d 2 缺损的铜绿假单胞菌 可对亚胺培南产生明显耐药性 1 l 1 。c a r me l i 和c a l a n d r a 等研究都发现， o p r d2 缺损多发生在亚胺培南治疗过 程 中发生 1 2 - 1 3 】 。而本研究结果也予以了证实，第一次 分离株p al 对亚胺培南敏感，而此时患者正接受亚胺 培南治疗 ，但在1 周后就出现对亚胺培南耐药，而且 荧光r t - p c r检测也发现o p r d2 表达减弱 。而改用舒 普深治疗 。值得一提的是， 目前有关亚胺培南治疗 与o p r d2 减少甚至丢失的时效性与发生率研究较少， c a l a n d r a 报道发生比例约为1 7 f l 3 】 。因此，有必要作 更多的临床调查加 以总结，确定亚胺培南治疗铜绿 假单胞菌感染的准确疗程。 此外 ，研究还发现，亚胺培南与美罗培南两者 似乎不存在交叉耐药，p al 、p a2 和p a4 都对美罗培 南保持敏感。其原因可能与美罗培南不通过o p r d 2 进 入细菌胞 内有关 。但是 ，由于美 罗培南是铜绿假单 胞菌主动外排系统me x ab op r m的底物 ，也存在继 发耐药的可能 】 。 目前有关亚胺培南与美罗培南治 疗铜绿假单胞菌感染 ，孰优孰劣 ，至今仍是争议的 问题【 1 。 虽然，近年报道铜绿假单胞菌可通过整合子或 7 2 0 抗生素压力下铜绿假单胞菌耐药机制变化 的动态研究 郭仲辉等 质粒介导的金属酶基 因，导致对碳青霉烯耐药。但 根据 国外调查 ，其发生率很低 _ l 4 ，而本次研 究也未 发现。相 比而言，膜通道表达减弱或缺失，仍然是 铜绿假单胞菌对碳青霉烯耐药的主要机制。 参 考 文 献 cl i n i c a l a n d la b o r a t o r y s t a n d a d s i n s t i t u t e p e r f o r ma n c e s t a n d a r d s f o r an t i mi c r o b i a l s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g s s i x t e e n t h i n f o r ma t i o n a l s u p p l e me n t ， 2 0 0 8 ， m 1 0 0 一 s1 8 陈东科， 张志敏 ， 张秀珍 三 维法检测 b 内酰胺酶 的影 响 因素探 讨及方 法 的改进 j 中华检 验 医学 杂志， 2 0 0 3 ， 2 6 ( 1 0 ) ： 6 0 0 6 0 4 付建荣， 刘群， 张艳红， 等 铜 绿假 单胞 菌1 3 一 内酰类抗生素 耐药相关基 因研 究 j 中国抗 生素 杂志， 2 0 0 6 ， 3 1 ( 7 ) ： 4 2 9 4 31 ro d r i g ue z m a r t i ne z j m ，poi r e l l， no r dma n n p ext e nd e d s p e c t r u m c e p h a l o s p o r i n a s e s i n p s e u d o mo n a s a e r u g i n o s a j a n t i mi c r o b a g e n t s c h e mo t h e r ， 2 0 0 9 ， 5 3 ( 5 ) ： 1 7 6 6 7 1 j a p o n i a， gu d a r z i m ， f a r s h a d s as s a y f o r i n t e g r o n s a n d p a t t e r n o f a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e i n c l i n i c a l es c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s b y p c r - r f l p i n s o u t h e rn i r a n j j i n f e c di s ， 2 0 0 8 ， 6 1 ( 1 ) ： 8 5 8 8 p6 r e z p6 r e z 1 f j ，ha n s o n n dde t e c t i o n o f p l a s m i d me d i a t e d a mp c l a c t a ma s e g e n e s i n c l i n i c a l i s o l a t e s b y u s i n g mu l t i p l e x p c r j jc l i n mi c r o b i o l ， 2 0 0 2 ， 4 0 ( 6 ) ： 2 1 5 3 2 1 6 2 li ve r m or e d m of ps e udomon as，por i ns ，pumps and c a r b a p e n e ms j ja n t i mi c r o b c h e mo t h e r ， 2 0 0 1 ， 4 7 ( 2 ) ： 2 47 25 0 8 】 ga t e s m l ， s a n d e r s c c ， go e r i n g r v e t a 1 e v i d e n c e for mu l t i p l e f o rm s o f t y p e i c h r o mo s o ma l 13 - 1 a e t a ma s e i n p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a j a n t i m i c r o b a g e n t s c h e mo t h e r ， 1 9 8 6 ， 3 o ( 2 ) ： 4 5 3 _ 4 5 7 9 1 0 1 2 1 3 1 4 ba g g e n，ci o f u 0，he n t z e r m ，e t a 1 co n s t i t u t i v e h i g h e x p r e s s i o n o f c h r o mo s o ma l 1 3 - l a c t a ma s e i n p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a c a u s e d b y a n e w i n s e r t i o n s e q u e n c e( i s 1 6 6 9 ) l o c a t e d i n a m p d j a n t i mi c r o b a g e n t s c h e mo t h e r ， 2 0 0 2 ， 4 6 ( 1 l 1 ： 3 4 0 6 - 3 4 1 1 pa i h，ki m j w ，ki m j ，e t a 1 ca r b a p e ne m r e s i s t a n c e me c h a n i s ms i n p s e u d o mo n a s a e r u g i n o s a c l i n i c a l i s o l a t e s j a n t i mi c r o b a g e n t s c h