科学仪器学复习内容第二部分

第一部分第一部分 PCR 及其相关的技术及其相关的技术 1. P C R 技术原理 PCR 技术实际上是 DNA 体外合成放大反应。其基本原理是根据细胞分裂中 DNA 的半保留 复制机理。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。 模板 DNA 的变性: 模板 DNA 经加热至 94 - 95一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备。 模板 DNA 与引物的退火(复性) 模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 40-70左右，引物与模板 DNA 单链的互补 序列配对结合。 引物的延伸: DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板， 按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链 又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟， 23 小时就能将待扩目的基因 扩增放大几百万倍。 2. PCR 反应体系 缓冲液；模板 DNA；引物；脱氧核糖核苷三磷酸（dATP dTTP dGTP dCTP)； TaqDNA 聚合酶；Mg2+ 3. 引物设计原则 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在 1530 碱基之间。 G+C 含量在 40%60%，两个引物的 Tm 值应基本接近(5 )，且以在 55 65为好。 碱基要随机分布。 引物自身 不能有连续 4 个碱基的互补（发夹结构） 。 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补 （引物二聚体） ，特别是一引物的 3端不能结合到另一引物。 引物 5端可以修饰 （标记、酶切位点等） 。 引物 3端不可修饰， 最好选 G/C，一般不放 A。 引物 3端要避开密码子的第 3 位。 4. PCR 的特点 （1）灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达 3 个 RFU 细菌检测的最小检出率为 3 个细菌 （2）简便、快速 一次性加好反应液，24 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 （3）对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提 DNA 5. RT-PCR 及其应用 RT-PCR 指逆转录 PCR, 是指从 RNA 或 mRNA 直接扩增获得目的 DNA 片段的过程. 主要应用：1）RNA 序列分析 2）基因表达研究 3）遗传病诊断 6. 荧光定量 PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应 过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。 7. 荧光定量 PCR 定量原理及计算方法 反应最初，虽然产物是指数增长,但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加.当累积了 足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即 CT。 由于 CT 值处于指数期内，这时的反应成份不会抑制扩增反应进行，因此荧光定量 PCR 结果是可靠的，可以准确地反应体系中模板的初始量。如果产物在每一循环都加 倍，荧光曲线之间的间距由等式“2n=稀释倍数“决定； n 为阈值线上扩增曲线之间的循 环数 （CT 的差值） 例如：10 倍稀释的 DNA 样品， 2n=10 因此 n=3.32，即 CT 值相差 3.32 个循环 8. 荧光定量 PCR 的应用 （1）实时监测产物量，计算初始模板量 （2）基础研究的基因表达分析研究 （3）临床病原体检测 病人体液中目标基因的检测：病毒,寄生虫,细菌 市场上有各种开发好的试剂盒 （4）食品卫生检疫 a.转基因食品的检疫：根据转入基因的特异性区段设计探针 b.食品中病原微生物的检测 第二部分第二部分 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化 1.蛋白质分离纯化的依据 蛋白质的分子大小 主要取决于蛋白质的肽链数目及每条肽链的氨基酸残基数目，透析、超过滤、分子筛 层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的； 蛋白质的带电特性 蛋白质肽链的氨基末端、羧基末端、酸性氨基酸残基的侧链 R 基以及碱性氨基酸残基 的侧链 R 基等，在不同的 pH 条件下会带有不同的电荷，等电点沉淀、离子交换层析、 等电聚焦电泳等都是以此为依据来分离纯化蛋白质； 蛋白质的溶解特性 大多数蛋白质在水溶液中会形成稳定的胶体溶液，易溶于稀酸、稀碱或稀盐等，当破 坏胶体稳定存在的条件时，蛋白质会沉淀析出，硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离 等均依据此原理； 蛋白质的变性与复性： 蛋白质在一定的物理化学条件下会失去原有的空间结构、生物学功能以及部分理化特 性等称为变性，在变性条件不剧烈，某些蛋白质在除去变性条件后会恢复原有的空间 结构和生物学功能即为复性。例如，采用尿素变性复性的方法从包含体中纯化原核表 达蛋白； 蛋白质的结晶： 天然蛋白质在一定的物理化学条件下，浓度达到过饱和状态时就会结晶析出，如从鸡 蛋中纯化溶菌酶等就可以采取结晶与再结晶的方法； 蛋白质分子表面的特性： 蛋白质分子表面疏水氨基酸残基的数目、比例以及分布区域不同，因此它们与吸附剂 的吸附作用力不同，蛋白质的吸附层析就是依据此原理； 蛋白质的分子形状： 不同的蛋白质具有不同的分子形状，因此其与特定的配基(或配体)具有专一的结合特性， 如酶与底物、酶与其抑制剂或激活剂，抗体与抗原，凝集素与葡聚糖等，亲和层析就 是以此为依据； 2. 蛋白质分离纯化与鉴定的主要步骤 （1（ 选择实验材料 （2（ 实验材料的预处理 （3（ 蛋白质的提取 （4（ 蛋白质粗分级 （5（ 蛋白质细分级 （6（ 蛋白质的鉴定 3. 蛋白质粗分级 方法 硫酸铵分级沉淀 有机溶剂分级沉淀 超速离心 等电点沉淀 透析 超滤 蛋白质结晶 4. 蛋白质细分级方法 分子筛层析 离子交换层析 亲和层析 聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、毛细胞电泳、 等电聚焦电泳等 5 蛋白质鉴定的相关要素 蛋白质分子质量 等电点 氨基酸组成及其顺序 免疫特性 结晶特性 生物学功能 6.实验设计大肠杆菌中表达的融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白的分离纯化 (1)选择实验材料：大肠杆菌(含有 His-GFP 表达质粒)在液体 LB 培养基中培养，离心， 除去 LB 培养基，收集菌体沉淀。 (2)实验材料预处理：用蛋白质提取缓冲液悬浮菌体，离心后收集菌体沉淀，再用蛋白 质提取缓冲液洗涤菌体一次，用少量提取缓冲液悬浮菌体，冰浴条件下超声波破碎 菌体，离心后的上清液即为绿色荧光蛋白粗提取液。 (3)蛋白质粗分级：将绿色荧光蛋白粗提取液装入透析袋中浓缩，透析除去小分子杂质。 (4)蛋白质细分级：使用镍亲和层析柱亲和纯化带有组氨酸标签的绿色荧光蛋白。 (5)蛋白质的鉴定：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定绿色荧光蛋白分子质量，使用荧光分 光光度计测定绿色荧光蛋白荧光光谱等。 7常用的分子筛层析凝胶 葡聚糖凝胶 （Sephadex） 琼脂糖凝胶（Sepharose ） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P） Sephacryl 凝胶 Superdex 凝胶 Superose 凝胶 其他凝胶：多孔硅胶 、多孔玻璃珠 8分子筛层析的原理 凝胶颗粒内部呈网孔状结构，分子质量大的蛋白质难以进入凝胶颗粒内部，主要从 凝胶颗粒的间隙里通过，所受阻滞作用小，所以大分子蛋白质迁移速度快，先流出凝 胶 。 分子质量小的蛋白质则容易进入凝胶颗粒内部，所受阻滞作用大，所以小分子蛋 白质迁移速度慢，后流出凝胶，从而将分子质量大小不同的蛋白质分开。 9离子交换层析原理： 蛋白质是两性分子，在一定的 pH 条件下带有电荷，不同的蛋白质所带有电荷的种类和 数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。这样，当蛋白质混合 物流经带电凝胶时，电荷吸引作用小的蛋白质先流过，而电荷吸引作用大的蛋白质后 流过凝胶，从而把不同的蛋白质分开。 10吸附层析原理 由于不同的蛋白质所含有的氨基酸的种类和数目不同，分子表面的极性氨基酸 和非极性氨基酸的数目、分布区域不同，因此它与分子比表面积大的吸附剂间的相互 作用力大小不同。根据此原理对蛋白质进行分离纯化。 11亲和层析原理： 亲和层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。 优点：一步得到高纯度的目标蛋白 缺点：制备特定蛋白质的专一性配体较为困难； 一种亲和层析介质只能纯化一种或一类蛋白，成本较高。 12蛋白质的鉴定基本方法 蛋白质含量测定 蛋白质纯度鉴定 蛋白质分子质量及等电点测定 蛋白质氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质免疫印迹(Western-blotting)鉴定 蛋白质生物活性及功能测定 第三部分 蛋白质组学 1蛋白质组学概念 蛋白质组(proteome)是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。 从蛋白质组的定义上就可以清楚看出，蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在 于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，它从一个机体或一个 细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律。 2蛋白质组学的难点 （1）蛋白质组的多样性：基因组作为遗传信息的载体，无论在什么样的生长条件下， 它是始终不变的，然而，对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的活动状态，蛋白 质组是具有多样性的。 （2）基因与蛋白质不是一一的对应关系： 一方面，人们已经发现有许多“拟基因”的存在，这些拟基因有和真基因相同的可读框， 但却从不表达；另一方面，由于存在 RNA 水平上遗传信息的加工一 mRNA 编辑和蛋白质 水平上遗传信息的加工一蛋白质剪接，许多蛋白质很难找到直接对应的可读框。所以，要 想找到一个生物体基因组的全部基因和相应的全部蛋白质是一个非常困难的任务。 （3）蛋白质组的动态性： 一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。而作为新陈代谢的主要执行 者的蛋白质组，在个体的生命活动中却总是变动不停。因为蛋白质的稳定性要比核 酸差得多，在制备的过程中可能会发生降解或丢失。 （4）蛋白质组的时空性： 而在蛋白质组的研究中，不仅要考虑时间因素，更要考虑空间的影响。首先不同的 蛋白质分布在细胞的不同部位。它们的功能与其空间定位密切相关。要想真正了解 蛋白质的功能，必须要知道蛋白质所处的空间位置。其次，许多蛋白质在细胞里不 是静止不动的，它们在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境里运动发挥作用。因此 对于亚细胞蛋白质组学来说有两个难点：一是如何对细胞进行恰当的分级分离；二 是如何区别亚细胞组成蛋白质和由于生理作用而在细胞不同区域进行运动的蛋白质。 3蛋白质组研究核心技术 蛋白质分离技术 (如双向电泳和多维液相层析)； 蛋白质鉴定方法 (如氨基酸序列分析和质谱技术） 生物信息学技术 4双向电泳 第一向: 等电聚焦（IEF）：等电聚焦是利用蛋白质分子的等电点不同，在一个稳定的、 连续的、线形 pH 梯度中进行蛋白质的分离和分析。 第二向:SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：SDS-PAGE 电泳是根据 SDS 和还原 试剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定的 pH 缓冲系统中的分离。 从而将蛋白质在一个二维平面分开。 5生物质谱技术 质谱技术是蛋白质组学研究中最为广泛使用的蛋白质鉴定技术。其基本原理是样品 分子离子化后，根据不同离子间质荷比（M/Z）的差异来分离并确定分子质量。质 谱技术能从复杂的样本中定性、定量分析蛋白质，其灵敏度高，可达到 fmol(10-15)乃 至 amol(10-18)，速度快，现已经成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。 6质谱仪关键部件 其中离子源和质量分析器是两个关键的部件。质量分析器决定着质谱的准确度、灵敏 度和分辨率等。离子源主要有基质辅助激光解吸咐（MALDI）和电喷雾（ESI） 7基质辅助离子化技术 试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。基质吸收激光束能量 后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。基质吸收大部分激光能量，减少了 试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。 8肽质量指纹图谱 MALDI-TOF-MS 常用于蛋白质的肽质量指纹图谱(peptidemass finger printing，PMF)鉴 定。PMF 是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于每 种蛋白质的氨基酸序列不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其 肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹图谱(finger printing)。将获取的肽质量指纹 图谱在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似 PMF 的蛋白质，就可以初步完成蛋白质的 鉴定。 第四部分第四部分 分子杂交技术分子杂交技术 1核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性 DNA 或 RNA 单链，经退火处理形成 DNA-DNA 或 DNA-RNA 这一过程叫分子杂交。 2核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链 DNA 或 RNA 混在一起时，其相应同源区段将会退火形 成双链结构。如把一段已知基因（DNA 或 RNA）核酸序列用合适标记物（如放射性同位 素、生物素等）予以标记，当作探针（probe), 与变性后的单链基因组 DNA 或 RNA 进行 杂交。再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确 定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。 3核酸分子杂交应用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。 4探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的 DNA 特异互补的已知核苷酸序列。 5探针标记的种类 同位素： 32P、35S、3H、125I 等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 6探针的标记方法 缺口平移法； 随机引物标记法；末端标记法；生物素光照标记法 7缺口平移法的原理 将 DNAase I 的水解活性与大肠杆菌 DNA polymerase I 的 53的聚合酶活性和 5 3的外切酶活性相结合。 首先用 E.coli 的 DNAse I 在探针 DNA 双链上造成缺口， 然后再借助于 DNA pol I 的 53外切酶活性，切去带有 5-磷酸的核苷酸；同时利用 该酶 53聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活 性同时作用，缺口不断向 3方向移动，DNA 链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代， 成为带有标记的 DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记 DNA 探针。 8随机引物标记法原理 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针 DNA 片段一起热变性，退火后， 引物与单链 DNA 互补结合，再在 DNA 聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在 其 3- OH 端添加标记的