第15章 核酸的研究方法

第十五章 核酸的研究方法 第一节 核酸的分离、提纯和定量测定 一、DNA 的分离 用1mol/L 的NaCl 制备组织匀浆，离心除去组织残渣，多次用苯酚处理使蛋白质变性，每 次处理后离心取上层水相，最后加2 倍体积的乙醇沉淀出DNA。 二、RNA 的分离 由于RNA 酶存在广泛，且十分稳定，破碎细胞时要加入胍盐破坏RNA 酶，试剂要用0.1% 的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制，器皿要高压灭菌或用0.1%的DEPC 处理，多次用苯酚或 氯仿处理使蛋白质变性，每次处理后离心取上层水相，mRNA 可用寡聚dT-纤维素亲和层 析从总RNA 中分离。 三、核酸含量的测定法 常用的方法是测定260nm 的消光度，用公式计算核酸的含量。 核酸的含量也可以用定磷法测定。 DNA 的含量可以用二苯胺显色法测定。 RNA 的含量可以用地衣酚显色法测定。 第二节 核酸的超速离心及核酸的凝胶电泳 一、核酸的超速离心 超速离心可以分离超螺旋DNA（密度大），线性DNA（密度小）和闭环DNA（密度居中）。 也可以分离RNA。 二、核酸的凝胶电泳 从细菌抽提得到的质粒DNA 样品中不含线状DNA 第三节 核酸的核苷酸序列测定 一、DNA 的酶法（末端终止法）测序 二、DNA 的化学法测序 DNA 酶法测序自动化： 使用4 种荧光素标记的双脱氧核苷酸，毛细管电泳和激光扫描技术使测序自动化，一个泳 道一次可测大约1000 个核苷酸，测序已成为可以快速完成的常规技术。人类基因组测序已 经完成，多态性的研究和功能基因组学已经成为研究的热点。 限制性酶切位点分析是绘制物理图的常用方法。 由于测序仪在一个泳道只能准确测出几百个核苷酸，对于长DNA，只能将其切成小段再测 序，为了组装，需要确定足够多的标记位点。 常用遗传图、转录图、物理图、序列标签位点(STS)、表达序列标签(EST)等方法确定标记 位点。 三、RNA 的测序 RNA 的测序可以用4 种特异性的酶切割（从胰脏提取的RNase A 水解嘧啶核苷酸的磷 酸二酯键，米曲霉中提取的RNase T1 水解鸟苷酸的磷酸二酯键，黑粉曲霉中提取的RNase U2 水解腺苷酸的磷酸二酯键，多头黏菌中提取的RNase Phy I 水解A、U、G 三种核苷酸 的磷酸二酯键），凝胶电泳分离，用类似蛋白质序列分析的方法推断核苷酸序列。 也可以用化学试剂断裂RNA 链，用类似DNA 化学测序的方法推断核苷酸序列。 最常用的方法是逆转录成cDNA，用DNA 测序的方法推断核苷酸序列。 第四节 聚合酶链反应（PCR） 一、PCR 的定义 PCR(polymerase chain reaction)是应用最广的分子生物学技术之一，模板DNA 的含量以指 数方式增加，可用来快速在体外扩增DNA，PCR 技术在临床检验和分子生物学中的应用 十分广泛。耐热DNA 聚合酶的发现推动了这一技术的广泛应用。 （二）复合PCR(multiplex PCR) 在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段的方法称复合PCR。复合PCR 主要用于同 一病原体 分型及同时检测多种病原体。此外也常用于多点突变性分子病的诊断。 （三）不对称PCR(asymmetric PCR) 两种引物比例相差较大的PCR 称不对称PCR。不对称PCR 可制备用于核酸序列分析的单 链DNA 片段或核酸杂交的探针等。 （四）反转录PCR(reverse transcription PCR) 由于Taq 酶只能以DNA 为模板，当待扩增模板为RNA 时，需先将其反转录为cDNA 才能 进行PCR扩增，这种PCR 技术称为反转录PCR，在分子生物学和临床检验等领域均有广泛 应用。 （五）涂片PCR(slide-PCR) 直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR 扩增的方法称涂片PCR。涂片PCR 结合原 位杂交技术特别适用于病理切片中含量较少的靶序列的PCR 检测。 （六）反向PCR(inverse PCR) 扩增引物相反方向DNA 序列的PCR 技术称反向PCR。在反向PCR 中，要先将含有一段已 知序列的感兴趣的未知DNA 片段进行酶切和环化，然后直接进行PCR，也可将已知序列 酶切后再进行PCR。反向PCR 主要用于已知序列两翼未知DNA 序列的扩增。 （七）锚定PCR(anchored PCR) 用酶法在一通用引物反转录的cDNA 3端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位 点对该cDNA 进行PCR 扩增称为锚定PCR，可用于未知cDNA 的制备及低丰度cDNA 文 库的构建。 （八）修饰引物PCR 为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的 5-末端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等，这种PCR 技术 称为修饰引物PCR。此外，还可将一些信号分子如荧光素、生物素等连接于引物的5末端， 当PCR 完成后可对产物直接进行检测。 PCR 在生命科学中的应用非常广泛，已有不少专著可供读者参考。 第五节 DNA 的化学合成 固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3-OH 与固相载体成共价键，5-OH 被4，4- 二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护，下一个核苷酸的5-OH 亦被DMTr 保护，3-OH 上的 磷酸基上有-N(C3H7)2 和-OCH3两个基团，3-OH 因此被活化。 每延伸一个核苷酸需四步化学反应： 脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr 用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5-OH。 缩合：新生成的5-OH 在四唑催化下与下一个核苷3-磷酰亚胺单体缩合使链增