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文档简介
糖尿病大鼠肾组织中糖尿病大鼠肾组织中 AKT 的表达及意义的表达及意义 来源:创新医学网 作者:石明隽,肖瑛,桂华珍,郭兵,张国忠 作者单位:贵阳医学院病理生理学教研室,贵 州 贵阳 550004 【摘要】目的观察 Akt1 和 Akt2 在糖尿病大鼠肾组织中的表达并探讨其是否参与糖尿病肾 病(DN)发病过程。方法链脲佐菌素(STZ)诱发大鼠糖尿病(DM),分为 2、4、8、12、16 w 和 24 w 组,每一时点均设相应的正常对照组。测定各组血糖、24 h 尿蛋白、血肌酐(Scr)、肾脏指数。 HE 和 PAS 染色光镜观察肾脏病理改变。免疫组化方法检测肾皮质 Akt1、Akt2、TGF-1、- SMA 和 FN 的表达,Western 印迹和 RT-PCR 法检测 Akt1、Akt2 蛋白及 mRNA 表达水平。结 果 DM 各组大鼠的血糖、24 h 尿蛋白、血肌酐、肾脏指数均较正常对照组明显升高 (P0.05,P0.01),免疫组化显示 DM 各组 TGF-1、-SMA 和 FN 阳性染色较正常组明显增多 (P0.01),以 12 w 增多最为明显,分别为 19.672.73、9.503.45、22.172.79,免疫组化、 Western 印迹及 RT-PCR 显示 DM 各组 Akt1 及 Akt2 蛋白和 mRNA 表达较正常组明显增多 (P0.01)。免疫组化显示 Akt1 与 TGF-1、FN 蛋白表达水平呈显著正相关 (r=0.694,r=0.532,P0.01),Akt2 与 TGF-1、FN 蛋白表达水平呈显著正相关 (r=0.789,r=0.743,P0.01)。结论 Akt1、Akt2 蛋白在 DM 大鼠肾组织过度表达,提示 PI3K/Akt 信号通路可能参与了 DN 的发病机制。 【关键词关键词】 Akt1;Akt2;转化生长因子转化生长因子 1;-平滑肌肌动蛋白平滑肌肌动蛋白;纤连蛋白纤连蛋白;糖尿病肾病糖尿病肾病 【Abstract】 Objective To observe the expression of Akt1 and Akt2 in renal tissues of diabetic rats and explore its effect in the development of diabetic nephrophy. Methods The diabetic rats induced by streptozotocin (STZ) were randomly divided into 2, 4, 8, 12, 16 and 24 w groups. Control group was installated at age-matched time points. Blood glucose, 24 h urine protein, serum creatinine (Scr) of rats were measured. The protein expression of Akt1, Akt2, TGF-1, -SMA and FN in renal cortex were detected by immunohistochemical staining. Western blotting and reversetranscriptase-PCR (RT-PCR) were employed to detect the protein and mRNA expression of Akt1 and Akt2. Results The levels of blood glucose, 24 h urine protein and Scr were increased remarkably in diabetic rats compared with those in control groups (P0.05, P0.01). The protein and mRNA of Akt1 and Akt2 were significantly up-regulated. The TGF-1, FN and -SMA protein were significant increased in DM rats as compared with those of the controls. Conclusions Akt1 and Akt2 gene and protein expression are up-regulated in the kidney of DM rats, and which may involve in the pathogenesis of diabetic nephropathy. 【Key words】 Akt1; Akt2; TGF-1; -SMA; Fibronectin; Diabetic nephropathy PI3K/Akt 通路是细胞内重要的信号转导系统,广泛存在于细胞中,参与细胞的生长、增殖 和分化调节。Akt 是该信号通路的中心环节, Akt 有 Akt1、Akt2、Akt3 三个亚型,其中 Akt1 和 Akt2 在人体各组织中普遍表达。肾小管-间质纤维化是所有慢性肾脏疾病包括糖尿病肾病 (DN)进展至终末期肾功能衰竭的共同通路,许多细胞内信号转导机制参与了其发展过程。彭红 霞等研究发现 PI3K/Akt 信号通路参与了单侧输尿管梗阻大鼠梗阻肾间质纤维化过程1。 Jana 等人研究显示在 1 型 DM 肾皮质 Akt 总蛋白表达水平未见变化2,在 2 型 DM 时肾皮 质 PI3K/Akt 信号通路被激活,Akt 总蛋白表达水平增加3。然而 DM 时肾组织 Akt 亚型的 表达和意义有待进一步阐明。为此,我们以 1 型糖尿病大鼠为对象,动态观察肾小管间质中 Akt1、Akt2、TGF1、-SMA 和 FN 的表达情况,初步探讨 PI3K/Akt 信号通路在 DN 发生发展 中的作用。 1 材料与方法 1.1 动物 SD 大鼠,雄性,体重(180200)g,上海西普尔-比凯实验动物有限公司提供许可证号: Scxy(沪)2003-0002。 1.2 主要试剂 链脲佐菌素(STZ,Sigma),兔抗大鼠 Akt1、Akt2、TGF1、FN 多克隆抗体、小鼠抗大鼠 -SMA 单克隆抗体、羊抗兔或小鼠 IgG-HRP、免疫组化 SABC 检测试剂盒、DAB 显色试剂盒、 ECM 化学发光试剂盒(武汉博士德公司),PVDF 膜(美国 Minipore 公司),RNAsimple Total RNA KIT(北京天根公司),ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(美国 Fermentas 公司), Akt1、Akt2 和 -actin 引物合成(上海捷瑞)。 1.3 动物模型及分组 72 只大鼠随机分成糖尿病 2、4、8、12、16 w 和 24 w 组(n=6),并设置相应时点的正常对照 组(n=6)。糖尿病组予以尾静脉注射 STZ 55 mg/kg,72 h 后测血糖,血糖16.7 mmol/L 者入选。 正常对照组予以尾静脉注射 STZ 溶媒(枸橼酸缓冲液)。所有大鼠予标准饲料喂养,自由饮水, 于处死前 1 d 用代谢笼收集 24 h 尿测尿蛋白。股动脉取血,测血糖和血肌酐,处死大鼠秤取双 侧肾脏重量,以肾重(mg)与体重(g)比值作为肾脏指数。一侧肾于 4%多聚甲醛固定用于病理及 免疫组化染色,另一侧肾于-80保存用于蛋白印迹和 RT-PCR 检测。 1.4 生化指标的测定 氧化酶法测血清中的葡萄糖浓度,考马斯亮蓝方法检测尿蛋白,苦味酸方法测血清中的肌酐浓 度,均按试剂盒说明书操作。 1.5 肾组织病理检查 多聚甲醛固定之肾组织制成 3 m 石蜡切片,行 HE、PAS 染色,光镜下观察肾组织形态结 构。 1.6 免疫组化 采用 SABC 法检测肾组织中 Akt1、Akt2、TGF1、-SMA、FN 表达,一抗工作浓度均为 1100。PBS 代替一抗,作阴性对照。每张切片从肾皮质外侧向内,自上向下随机取 10 个高倍 视野(400),以肾小管细胞胞浆及(或)胞核内出现棕褐色颗粒为阳性信号,计数阳性染色的肾小 管数,取均值表示 Akt1、Akt2、TGF1 和 -SMA 表达程度。FN 的表达则参考郭兵等4文 献的方法进行计数,以 10 个高倍镜视野下的阳性点数取均值。 1.7 Western 印迹 取-80保存的肾皮质 100 mg,加裂解液匀浆,离心取上清测定蛋白含量,每泳道加 50 g 蛋白质,经 SDS-PAGE 垂直凝胶电泳后,电转移至 PVDF 膜。用含 5%脱脂奶粉的 TBS 室温封 闭 2 h,TBST 洗膜后加 Akt1 抗体(1200)、Akt2 抗体(1200),4孵育过夜;洗膜后加羊抗兔 IgG-HRP 室孵育 2 h,TBST 洗膜后用 ECL 试剂按说明曝光显影。 将孵育 一抗的膜用抗体剥 脱液剥脱后,按同样的方法与 -actin 抗体(1500)孵育,二抗用羊抗小鼠 IgG-HRP。用 BOI- RAD Chemo Doc XRS 凝胶成像系统及 Qantity One 软件进行图像分析。以 -actin 蛋白条带作内 参照,计算 Akt1 和 Akt2 蛋白与 -actin 蛋白条带灰度的比值为 Akt1 和 Akt2 蛋白表达的相对水 平。 1.8 RT-PCR 检测 Akt1 和 Akt2 mRNA 表达 取 50100 mg 肾皮质加入 1 ml Trizol,匀浆器冰上充分匀浆,按 RNAsimple Total RNA KIT 说明提取总 RNA,核酸蛋白分析仪检测 RNA 浓度,按照 Re vertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明合成 cDNA。PCR 的引物序列 Akt1 上游引物 5- AATACCTGGTGTCGGTCTCA-3、下游引物 5-TCGAGCTCATCCTAATGGAG-3; Akt2 上游引 物 5-ATGGTAGC CAACAGTCTGAAGC-3、下游引物 5-TTGCCGAGGAGTTTGAGATAAT- 3;-actin 上游引物 5-CTAGAAGCATTTGCGGTGGA-3、下游引物 5-GAAATCGTG CGTGACATTAAG-3。反应条件:94预变性 5 min,94变性 30 s,退火 30 s(Akt1 退火温度 61.5,Akt2 退火温度 63,-actin 57.4),72延伸 30 s,Akt1 循环 30 次、Akt2 循环 34 次、-actin 循环 30 次后 72充分延伸 10 min。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像 系统和 Quantity one 软件进行图像分析。以 -actin 作内参照,计算 -catenin 与 -actin 灰度比 值表示其 mRNA 相对表达量。 1.9 统计学处理 实验结果以 xs 表示,采用 SPSS11.0 统计软件包进行单因素方差分析,Pearson 法进行相 关分析,检验水准取 =0.05。 2 结 果 2.1 生化指标测定结果 糖尿病组各时点的血糖维持在稳定的高水平,24 h 尿蛋白、血肌酐、肾脏指数均从 2 w 开 始显著升高,与正常对照组大鼠相比有显著性差异(P0.01,P0.05),见表 1。表 1 各组大鼠血 糖、24 h 尿蛋白、血肌酐、肾脏指数 2.2 肾组织病理变化 HE 和 PAS 染色见正常大鼠肾小球及肾小管结构清晰,肾小管上皮细胞排列整齐,基底膜 完整,间质中未见细胞浸润。DM 组大鼠 4 w 后可见肾小管上皮细胞变性,部分肾小管腔内有细胞 和管型,肾小管管腔扩张,上皮细胞萎缩,间质有较多细胞浸润,肾小管基底膜不规则增厚,肾小管- 间质内紫红色染色物明显增多。 2.3 免疫组化结果 Akt1 和 Akt2 在正常组大鼠和 DM 组肾小球未见表达,在正常组肾小管上皮细胞胞浆有少 量表达,DM 组大鼠肾小管上皮细胞胞浆表达明显增多。正常对照组大鼠无 TGF-1 蛋白表达, DM 各组大鼠肾小球和肾小管可见 TGF-1 阳性染色。正常大鼠 -SMA 只在血管壁表达,DM 大鼠从 2 w 开始肾间质细胞胞浆内有 -SMA 阳性染色,8 w 可见部分肾小球系膜细胞胞浆阳性 染色,16 w 时部分 DM 大鼠肾小管上皮细胞胞浆内可见阳性表达,并随病程延长细胞阳性染色 增多。正常组大鼠肾间质无 FN 阳性表达,肾小管基底膜可见 FN 线性表达,DM 组大鼠肾小管 -间质 FN 表达从 2 w 开始逐渐增多,与对照组比较差异有显著性,见表 2、图 1。 2.4 Western 印迹结果 Western 印迹显示,正常对照组大鼠肾皮质可见 Akt1 和 Akt2 蛋白少量表达,DM 各组大鼠 Akt1 和 Akt2 蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性,并随 DM 病情进展持续在高水平。 见表 3,图 2。 2.5 RT-PCR 结果 正常对照组大鼠肾皮质可见 Akt1 和 Akt2 mRNA 少量表达,DM 组大鼠 2 w 开始 Akt1 和 Akt2 蛋白表达增加,随 DM 病情进展持续在高水平,与正常对照组相比差异有显著性。见表 4,图 3。 2.6 相关性分析 免疫组化结果显示,Akt1 与 TGF-1、FN 蛋白表达水平呈显著正相关 (r=0.0.694,r=0.532,P0.01),Akt2 与 TGF-1、FN 蛋白表达水平呈显著正相关 (r=0.789,r=0.743,P0.01)。表 2 各组大鼠肾小管 Akt1、Akt2、TGF-1、-SMA、FN 免疫组 织化学阳性表达 图 1 正常组和 DM 组 16 w 时 Akt1、Akt2 蛋白表达(DAB,400)C 为正常 对照组,2 w、4 w、8 w、12 w、16 w 和 24 w 分别为 DM 各组 图 2 Western 印迹结果显示各 组大鼠肾皮质 Akt1 和 Akt2 蛋白表达水平表 3 Western 印迹显示各组大鼠肾皮质 Akt1 和 Akt2 蛋白表达水平表 4 RT-PCR 显示各组大鼠肾皮质 Akt1 和 Akt2 mRNA 表达水平图 3 各组大鼠肾 皮质 Akt1 和 Akt2 mRNA 表达水平 3 讨 论 PI3K/Akt 是细胞内重要的信号转导系统,当细胞受生长因子等刺激因子刺激后,细胞内 PI3K 活化,使 4、5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)转化为 3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3),并与其 下游分子 Akt 结合使 Akt 活化,活化的 PI3K/Akt 参与细胞增生、分化、移行等的调节 5,6;本研究免疫组织化学和 Western 印迹观察到 DM 大鼠从 2 w 起肾小管 Akt1 和 Akt2 表 达增多,并在整个病程期间持续高表达,与 mRNA 检测结果一致。提示在糖尿病动物肾小管 上皮细胞中 Akt 在转录水平发生改变,其变化可能与高血糖有关7,且 Akt1 和 Akt2 增高幅 度相似。 肾小管间质纤维化是多种慢性进展性肾脏疾病包括 DN 发展至终末期肾功能衰竭的共同通 路,其病理特征为正常的肾小管和肾间质被大量聚集的细胞外基质所代替。在肾间质纤维化中, 均有细胞外基质(ECM) 的堆积,同时肾小管上皮细胞转分化(EMT)在肾小管间质纤维化过程中 发挥重要作用。TGF-1 可通过多个信号通路介导肾小管上皮细胞转分化过程,并对间充质细胞 和成纤维细胞有促生存作用,从而引起细胞间基质蛋白分泌增加57。肌成纤维细胞能够分 泌大量的胶原和纤维连接蛋白,使细胞外基质沉积,而 -SMA 是其标志性蛋白。本实验免疫组 化结果显示正常对照组大鼠肾小管上皮细胞无 TGF-1 蛋白表达,DM 各组大鼠中肾小球和肾 小管可见 TGF-1 阳性染色,同时 DM 大鼠从 2 w 开始在肾间质细胞胞浆内有 -SMA 阳性染色, 16 w 时部分 DM 大鼠肾小管上皮细胞胞浆内可见阳性表达,并随病程延长细胞阳性染色增多, 与 TGF-1 表达增加一致,提示在 DM 大鼠肾组织中有成纤维细胞活化和肾小管上皮细胞向肌 成纤维细胞表型转变,且这种表型转变可能为 TGF-1 所介导。同时我们还观察到随着病程发 展,肾小管间质区 FN 增多,与 -SMA 增加相一致,提示 DM 大鼠肾小管间质 ECM 成分 FN 沉积 增多可能部分来源于肌成纤维细胞。 有研究显示 PI3K/ Akt 信号通路参与了 TGF-1 介导的肾小管上皮细胞转分化过程8,9。 TGF-1 可激活 PI3K/Akt 信号通路,促使其下游转录因子转录,使蛋白合成增加,肾脏肥大和 ECM 沉积,促进肾小管间质纤维化从而引起 DN 的发生。本研究相关性分析显示,Akt1 与 TGF-1、FN 的表达水平呈正相关(r=0.694,r=0.532,P0.01),Akt2 与 TGF-1、FN 的表达水平 呈显著正相关(r=0.789,r=0.743,P0.01),提示在 DN 时 Akt1 和 Akt2 可能参与了 TGF-1 介导 的大鼠肾小管上皮细胞转分化过程,从而促进了 DN 的发生发展。 【参考文献】 1 彭红霞,陈 明,张 超,等.单侧输尿管结扎对大鼠肾间质 PI3K/AKT 表达的影响J.基础 医学与临床,2006;26(12):1345-9. 2 Zdychova J,Vesela J,Kazdova L,et al.Renal activity of Akt kinase in experinebtal type diabetesJ.Physiol Res,2008;57:709-15. 3 Zdychova J,Ludmila K,Terezie P,et al.Renal activity of Akt kinase in Obese Zucker ratsJ. Exp Biol Med,2008;233:1231-41. 4 郭 兵,肖 瑛,万昌武,等.糖尿病大鼠肾小管 TGF-1 和 MAPK1/3 表达的动态观察J.中 国病理生理杂志,2004;20(9):1681-5. 5 Xu G,Zhang W
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