细胞培养操作指南

细细胞培养操作指南胞培养操作指南 1，原代，原代细细胞培养胞培养 原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组 织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于 解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培 养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。 （5）营养丰富 的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛 马的血清更好。(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用 70%乙 醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入 BSS 或培养基中。不 要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。若必须推迟，可保 存在 4，72h。 1. 剪切组织剪切组织 先将所取得的组织，用 D-Hanks 或 Hanks 液清洗，以去除表面 血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。再次清 洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中， 加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状， 约 1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓 冲液再清洗一次。 2. 消化分离消化分离 消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的 单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原 酶。 3. 培养培养 细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为 25105 cellsm1，或实验所需密度。分装于培养瓶中，使细胞悬 液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置 CO2培养箱内， 5CO2，37静置培养。一般 35d，原代培养细胞可以粘附于瓶 壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量 12 的新培养液，继续培 养 23 d 后换液，一般 714 d 可以长满瓶壁，进行传代。 注意事项：注意事项： 1. 无菌操作 细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加 强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难 消除。 2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。 由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定 的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。 3. 小牛血清 小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增 殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。 一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。 4. 胶原酶溶液 必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20低温 保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。 5. L谷氨酰胺 几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细 胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因 生长不良而死亡。谷氨酸胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培 养液在 4冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。 6. 静置培养 原代细胞在消化分离后，置于 CO2培养箱的头 24- 48h (必要时 72 h)内，应处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶 观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增 殖。这对初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成份会消耗光， 在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培 养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。 7. 消化时间 一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为 此时组织颗粒已经松散，略经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的 消化往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。 8. 其它生长因子经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以 成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子。 如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外,内毒素、 EGF、FGF 等均有促有丝分裂作用，但费用较高。 原代外植（组织块培养） 简介：组织切碎并清洗，组织块接种于培养瓶或皮氏培养皿的 表面，加入少量含高浓度血清（40%-50%）的培养基，表面张力使 标本保持原位，直到他们自发地贴附于表面，随后细胞开始生长。 此方法适合小量组织培养，如皮肤活检组织，为了尽可能减少细胞 损失，而不用酶或机械方法。 操作流程：切割细切沉淀清洗清洗后用吸管转入培养瓶 倾斜培养瓶吸出平衡盐溶液然后加入一薄层培养基培养 2-3w, 无菌材料：培养基（DMEM 与 F12 等体积混合，再加 20%胎 牛血清） ；100ml 的 DBSS;9cm 皮氏平皿，非组织培养级别；尖头 镊子，尖头手术刀；100ml 广口移液器；15 或 20ml 离心管；25 平 方厘米的培养瓶或 5 厘米的皮氏培养皿，大约 100mg 组织用 5 个 25 平方厘米的培养瓶。开始每瓶放 1ml 培养基，随后 3-5 天每瓶加 至 5ml. 操作步骤： 1，将组织移入新鲜无菌 BSS 浸洗 2，移入第 2 个培养皿切除多余组织，如脂肪或坏死组织， 用手术刀交叉切成约 1mm3的小块。 3，用移液管（先用 BSS 浸润，否则组织块易贴壁）将组 织块移入 15 或 50ml 离心管或普通容器中，让组织块静置沉淀。 4，用 BSS 重悬冲洗组织块后静置，去除上清液，重复两 次或更多 5，将 20-30 个组织块接种在 25 平方厘米的培养瓶内（记 住湿润移液管） 6，将培养瓶静置放置一会，待组织块沉下去，然后稍微倾 斜吸出液体，然后以每 25 平方厘米生长面加入 1ml 的培养基，缓 缓倾斜培养瓶让组织块均匀分布于生长面上。 7，盖上瓶盖，放到 37培养箱中 18-24h. 8, 如果组织块已经贴附，则可在未来 3-5 天内将培养基加 至 5ml.先预温，以后每周更换一次，直到细胞已生长 9，外植块可以自生长中心用镊子取出，用预先浸洗的移液 管移入新的培养器皿中， ，然后盖上盖子，再继续培养。 10.更换第一瓶的培养基直至细胞生长超过生长面积的一半， 此时细胞可以传代。 总结：此种方法贴壁率很低，但是可用通过一些方法进行改进。如 在外植物的上方放一块盖玻片，或将外植物置于盖玻片的边缘， 2 酶的解离消化 组织中细胞与细胞之间的粘附是依靠多种相互作用的同类糖蛋白分 子，其中部分粘附分子具有钙离子依赖性（钙粘素） ，故对 EDTA 较为敏感，螯合素含有钙离子结合结构域，可结合到细胞外机制中 的 RDG 序列。细胞间基质和基底膜中含有其他糖蛋白对蛋白酶较 为敏感；选择消化液最容易的方法是从单一的消化液入手，过渡至 复合的消化液，开始用胰蛋白酶或胰蛋白酶/EDTA 的混合物，后加 入其他蛋白酶促进消化。由于新生和成年动物细胞经开始分化，纤 维结缔组织及细胞外基质增多，未分化的增殖细胞减少。对组织进 行分离时，损害愈严重（长时间的胰酶消化，搅拌） ，组织越易被破 坏成碎片，为了保持最大活性，无论酶的纯度如何，应该最大限度 的减少胰蛋白酶对细胞的作用时间。当整块组织在 37的胰酶中消 化时，已分离的细胞应每隔半小时收集一次，胰蛋白酶经离心去除， 再以含血清的培养基中和。即可以应用冷消化或温胰酶消化。 2.1 胰酶的温消化 此技术适应于在相当短的时间消化大的组织尤其是整个小鼠胚胎或 鸡胚。由于成年组织有大量纤维结缔组织，故成年组织不用此法。 较敏感的细胞如上皮细胞也不用此法。 无菌材料：组织 1-5g,DBSS50ml,用 PBSA 或正常生理盐水配 制的 2.5%粗制胰酶；PBSA 200ml,含血清的生长培养基 （DMEM/F12 加 10%胎牛血清） ；培养瓶，每克组织 5-10 个(根据 培养的细胞不同而改变） ；9cm 皮氏平皿，非组织培养级别；两个 50ml 离心管；250ml 锥形瓶；磁力搅拌子在试管中高压消毒；弯头 镊子，2ml,10ml 移液管。 非灭菌材料：磁力搅拌器，细胞计数板 操作步骤： 1，将组织块移入加有新配制的无菌 DBSS 皮氏培养皿中， 清洗 2，转入另一培养皿，切除多余组织如脂肪或坏死组织，用 刀切成约 3mm3小块 3，用弯头镊将组织移入 15ml 或 50ml 无菌离心管或容器中， 让组织块沉淀 4，用 DBSS 清洗组织块，组织块沉淀，去除上清液，如此 反复 2 次以上。 5，将组织块转入一个空的锥形瓶中，去除多余液体，然后 加入 180ml 的 PBSA， 6，加入 2.5%的胰酶 20ml。以使胰酶最终浓度为 0.25% 7, 在锥形瓶中加入搅拌子 8，封住锥形瓶，放到搅拌器上，在 37 摄氏度温箱内搅拌 9，每分钟 100r, 30min 10,30min 后，收集解离的细胞: 让组织块沉淀； 吸出上清 液，置入离心管中，放在冰上，向锥形瓶中加入新的胰酶溶液消化 剩余的组织块，继续搅拌并孵育 30min; 收集的细胞悬液以 500g,5min 离心; 用 10ml 含血清培养基重悬细胞团，储存于冰浴中。 11，重复第 10 步的过程直至消化完全为止（大约 3-4h) 12, 收集冷的细胞悬液，用血球计数板进行细胞技术，并 检测细胞活性 13，将细胞悬液用培养基稀释，使每毫升培养基含有 1 x 106个细胞。接种到培养瓶中，大约每平方厘米为 2 x 105个细胞。 但是对于存活率不明确或难以预知时，细胞计数无价值。此时建议 每毫升 5-25mg 组织的浓度接种。 14，每隔 2-4 天更换一次培养基（以 PH 下降为标准） 。由 于部分细胞粘附较慢甚至易于悬浮生长，所以更换上清液前要先检 查上清液中存活的细胞。 总结;此方法应该把握时间，减少对细胞的损伤。可以通过如下简单 方法来减少细胞的损害：在 4将组织浸入胰酶，胰酶此时活性很 小的条件下浸透组织，然后放在 37， 在很短时间即可将组织消 化。 2.2 胰酶的冷消化 无菌材料：培养基（DMEM/F12，含 10%胎牛血清） ；DBSS; 0.25%粗制胰酶溶于无血清的 RPMI1640 或 MEM/Stirrer salts(S- MEM)中；9cm 皮氏平皿，非组织培养级别；直头，弯头镊子；剪 刀；25ml 螺口锥形瓶；25cm2、75cm2培养瓶；2ml,10ml 移液器 非灭菌材料：冰浴 操作步骤： 1，将组织移入加有新配制的无菌 DBSS 的皮氏培养皿中， 清洗。 2，转入另一培养皿中，切除多余组织如脂肪和坏死组织， 用手术刀细切成大约 3mm3的小块，对于胚胎器官若小于 3mm3可 以全部保留 3，用弯镊子将组织块移入 15ml 或 50ml 无菌离心管或普 通容器中，让组织块沉淀 4，用 BSS 重悬冲洗组织块，沉淀后去除上清，重复此步 骤 2 次以上 5，去除剩余液体，每克组织加入 10ml 溶于 RPMI1640 的 0.25%胰酶，置于 4。 6，在 4放置 6-18h, 7,小心去除胰酶，余下组织及残余胰酶（若需要此时可以 加入 1-2ml 其他酶） 8,37，放置 20-30min 9,加入温培养基，大约每 100mg 初始组织加 1ml，轻轻吹 打混合物至组织完全分散开。 10，若部分组织未分散，细胞悬液可以用无菌的平纹纱布 或不锈钢（100-200 微米）或 falcon 70mm 细胞滤器进行过滤细胞。 如果有较多的组织时，可在每克组织多加入 20ml 培养基促进沉淀 和随后的悬液收集，通常 2-3min 就足以去除大多数的大块组织。 11，用血球计数板测量并定量细胞密度 12，将细胞悬液用培养基稀释，使每毫升培养基含有 1 x 106个细胞，接种培养瓶中同上要求。 13，隔 2-4 天更换一次培养基（以 ph 下降为标准） 。由 于部分细胞粘附较慢甚至易于悬浮生长，所以更换上清液前要先检 测上清液中的存活细胞。 总结：与温消化相比，冷消化可以获得较高的细胞存活率， 24h 生存率。可保留更多的细胞种类。但是不适合大块组织（大于 10g),可以用于小鼠胚胎的上皮细胞，胚鼠的肝脏血细胞培养。 2.3 细胞传代时，细胞与培养皿的分离 （1）传代时应检测细胞活力，活力好的细胞应该密度小，活 力差的细胞应该密度高些。 （2）吸出过多的细胞培养基，用不含有钙离子和镁离子的平 衡盐溶液或 EDTA 溶液冲洗细胞。从培养瓶中与细胞生长面相对的 一侧加入冲洗液，摇晃培养瓶 1-2 分钟，冲洗细胞层倒掉冲洗液 （3）按照 2-3ml/25cm2的用量，从培养瓶中与细胞生长面相 对的一侧加入所选的解离液，确保解离液可覆盖细胞层，将培养瓶 置入 37条件下培养，轻轻摇晃培养瓶，通常细胞会在 5-15 分钟 内解离。不同细胞系解离所需的时间可能有所差异。对于难以从基 质上分离的细胞系，可通过拍打培养瓶的方式加速细胞分离。 （4）细胞完全分离后，将培养瓶呈直立位放置，使细胞流至培 养瓶底部，向培养瓶中加入完全培养基，反复吹打单层细胞表面， 使细胞分散。计数细胞并传代。 要求：对于大多数细胞系或强贴壁性细胞系，用不含钙离子和 镁离子的 PBS 进行冲洗，解离液用 0.25%的胰蛋白酶或胰酶 +EDTA，以不含有钙镁离子的平衡盐溶液进行配制. 2.4 原代组织中的细胞解离 （1）首先无菌采集组织，切除不需要的组织，用无菌手术刀或 者剪刀将余下的组织切成 2-4mm 大小的碎块。用不含有钙镁离子的 平衡盐溶液重新悬浮组织碎块，进行清洗。待组织块沉淀后，吸出 上清液。反复冲洗 2 至 3 次。 （2）将装有组织块的容器置于冰上，吸出所有的上清液，加入 含有 0.25%胰酶，不含钙离子和镁离子的平衡盐溶液（100mg 组织 加入大约 1ml 胰蛋白酶溶液。 （3）在 4下孵育至 6-18 小时，以便通过最小的胰蛋白酶活 性获得最大的穿透效果。 （4）小心倒掉过量的胰蛋白酶溶液，将组织块与残留的胰蛋白 酶溶液在 37条件下共同孵育 20-30 分钟。 （5）向组织块中加入加热的完全培养基，轻轻吹打，使组织分 散。如果使用无血清培养基，则还需要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 （6）用灭菌的纱布或者无菌不锈钢纱网（100-200m）过滤 细胞悬液，使残余的组织完全分散，计数并接种细胞。 3 细细胞胞传传代培养代培养 传代传代 当细胞密度（每平方厘米基质的细胞数）达到铺满整个瓶底的有效 基质时，或者当细胞浓度（每毫升培养基的细胞数）超出培养基的 能力时，细胞生长停止或生长速度大大放缓。这时就需要更频繁地 更换培养基或者进行分瓶培养。 传代标准：用于判定单层细胞是否需要传代 （1）细胞密度：正常细胞长至彼此汇合时需要传代。转化细胞 同样如此 （2）培养基耗尽：一般 ph 降低伴随着细胞密度的增加，这是 需要传代的主要指标。 （3）距上次传代的时间：常规穿戴最好依照严格的时间进行。 若到了该传代的时间细胞还没有达到足够高的密度（即细胞没有彼 此汇合） ，则应增加接种密度；相反，如果细胞很快彼此汇合，则要 降低接种密度。从而使在一定的接种密度下细胞的周期性生长将与 培养时间和细胞产量相一致。理性的细胞浓度是使细胞每 3-4 天更 换培养基，每 7 天传代。 传代所需无菌材料： 完全生长培养基；以 PBS 配制的终浓度为 0.25%胰酶；培养 瓶。 非灭菌材料： 血细胞计数板或电子细胞计数仪 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶 的瓶子放入 37水浴锅内预热。 2.用 75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。将试剂及 材料置于超净台上，.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间， 不仅便于操作而且可减少污染。 3.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 4.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟 再次消毒。 5.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉 球擦拭好后方能放入超净台内。 6.需要传代按以下操作 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦 拭显微镜的台面，仔细检查培养物有无污染或衰退迹象，根据传代 标准对该培养物进行观察并决定是否需要传代， 7.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒，弃 去旧培养基，为了避免冲散细胞，沿培养瓶细胞对侧加入 PBS（0.2ml/cm2） ，清洗细胞，去除清洗液，以去除残留血清。 加胰酶（0.1ml/cm2）到培养瓶细胞面对侧，翻转培养瓶平放以确 保胰酶完全覆盖细胞层，静置 15-30s,弃去大部分胰酶，只保留少量 胰酶，主要不要使单层细胞脱落。使用 4的胰酶可以防止细胞的 成片脱落。 8，平直培养瓶孵育，直至细胞变圆隆起，竖直培养瓶，单层细 胞就会从培养瓶表面滑落（通常发生在 5-15min 之后） ，注意不要消 化过长时间，另一方面也不要在细胞消化好前强制将细胞吹打下来， 这样将导致细胞的成片脱落。 9，加入培养液（0.1-0.2ml/cm2） ，用吸管反复吹打单层培养细 胞面以分散细胞，最后将吸管的尖端放于培养瓶底角，上下吹打细 胞几次，注意不要产生气泡。充分上下吹打以分散细胞使之处于单 细胞悬浮状态。吹打的强度对于各个细胞系有所不同，有的细胞系 很容易吹散，而有的则需要大力吹打才能分散。但若吹打力量过大， 几 乎所有的细胞都会受到剪切力的机械损伤。原代或早期几 代培养的细胞由于他们较脆弱和体积较大而尤其容易受到损伤，对 于连续细胞系具有较大弹性，需要大力吹打才能完全解离。 10，制备单细胞悬液有助于计算细胞增值率或贴瓶率或进行细胞克 隆分离。 11，用血细胞计数板进行细胞计数 12，稀释悬液到合适的接种浓度。方法一：加入适量细胞悬液到 含有已知体积培养基的培养瓶中，此方法适合常规传代，传代瓶数 不多且不需要准确的细胞计数和细胞增殖能力的检测。方法二，稀 释细胞至所需的总体积，然后分装到各个培养瓶中。此方法适用于 同时做多个相同的培养，因为操作的次数减少，而且每一培养瓶中 细胞密度完全一致。 13，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱 中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺 展面积占培养瓶底面积 25时为一个，占 50为，占 75 时为。盖上培养瓶盖，将培养瓶放回孵育箱中，大约 1 小时 后检查 ph 的变化，如果培养基在空气相中 ph 升高，则要将培养瓶 移至无菌区域内，向其中快速（1-2s)吹入 5%CO2，如果在 5%CO2 培养条件下 ph 还是很高，则可以增加 CO2 浓度到 7%尝试。 但是此方法不可常用，如果问题长存在可以在配置培养基时降低其 ph，同时在培养箱中检查培养基的 ph. 注意事项： 1，在任何情况下，主要的细胞分离剂，不论是胰酶还是 EDTA，仅做短暂停留，弃去大部分消化液后，仅留少量消化液进 行孵育。如果在分离细胞及以后的制备单细胞悬液过程中遇到困难， 可采用替代步骤如下。 （1）对于有丝分裂期细胞及其他粘附较松的细胞，可以通 过轻微机械振荡，摇晃，或大力吹打，进行细胞解离 （2）对于不可用蛋白酶的细胞系如受体或细胞表面蛋白分 析，以及可造成一些细胞伤害，很难形成单细胞悬液的条件下，利 用细胞刮刀进行刮擦。 （3）多数的连续细胞系，在用 0.01-0.5%粗胰酶，并经完 全去除培养基预处理条件下，可以只用胰酶即可将细胞分离。 （4）某些粘附性强的连续细胞系和很多早期细胞，用 0.25%粗胰酶，及 PBSA 作为培养基预处理后，可以通过清洗+胰酶 方法将细胞解离。 2，当把塑料培养瓶放入到培养箱中会因为培养瓶内空气的 膨胀使得较大的培养瓶膨胀而不能放平。可以将培养瓶放入培养箱 中 30min 后快速拧松瓶盖以减轻压力，或者可以在盖紧培养瓶前通 过挤压培养瓶的顶部或底部来解决这问题。 传代时的细胞浓度传代时的细胞浓度 最好的确定方法是以不同的接种浓度接种后作生长曲线，依此选择出 延迟期短，能很快进入对数生长期（倍增时间短） ，并且下次传代时 可以方便地到达 对数生长期最高点的最小接种浓度。对于新的培养 物，可以先以高浓度接种，再逐渐降低接种浓度直至获得合适的生长 周期 而培养物又无衰退表现。 1吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。 2向瓶内加入胰蛋白酶液和 EDTA 混合液少量。以能覆盖培 养 瓶底为宜。 3置 37孵箱或室温（25温度）下进行消化,25min 后把 培养瓶放在倒置显微镜下进行观察,当发现胞质回缩、细胞间隙增大 后，应立即中止消化。 4吸出消化液，向瓶内加入 Hanks 液少量，轻轻转动培养瓶， 把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化,在 吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培养液,终止消化。 5使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁 细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用 力过猛损伤细胞。 6用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置 CO2培养箱 中进行培养。 7细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。 一般 23 天后应换一次生长液。待细胞铺满瓶皿底面，即可使用。 也可继续传代扩大培养或换成维持液。 注意事项：注意事项： 1. 掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁 脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。 2. 掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过 低时细胞消化时间相对延长。 4 细细胞的胞的冻冻存及复存及复苏苏 细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞再次长到覆盖率 80-90% 左右，将其消化后，常规冻存（冻存液要现配） 。细胞冻存在-196液氮中，储 存时间几乎是无限的，若细胞冻存在-152，保存期为一年，一年内需复苏重 新冻存，冻存复苏的原则是慢冻快融。 1冻存细胞冻存细胞 （1）选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前 1d 换液。 （2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达 5106m1 左 右密度，离心，去上清。 （3）加入配制好的冻存液（培养液 6.8ml，小牛血清 2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml） ，按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用 吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂 10二甲基亚砜 (DMSO) 或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。 （4）分装于无菌冻存管中，每管加 1.5m1 悬液。 （5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，作好标记。 （6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1min 的速度,在 3040 min 时间内,下降到液氮表面，再停 30 min 后，直接投入液氮中。要适 当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。或 将细胞冻存于-152冰箱。 操作时应戴防护眼镜和手套，以免冻伤。 2. 复苏细胞复苏细胞 细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196液氮中的细胞快 速融化至37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融 化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 (1) 实验前准备： 1.将水浴锅预热至37 2.用75酒精擦拭紫外线照射30min 的超净工作台台面。 3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等 等。(2)取出冻存管： 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号的冻存管。 2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 (3)迅速解冻： 1.迅速将冻存管投入到已经预热的36-37水浴锅中迅速解冻，并要 不断的摇动，使管中的液体迅速融化，3060s 内完成。 2.约1-2min 后冻存管内液体完全溶解，取出用70%酒精棉球擦拭冻 存管的外壁，再拿入超净台内,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心 管中,再滴加10 m1培养液。 (4)平衡离心： 用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min 或者低速离心 (5001000rmin) 5 min，去上清后再用培养液洗一次。 (5)制备细胞悬液： 1.吸弃上清液。 2.向离心管内加入10ml 培养液，吹打制成细胞悬液。 (6)细胞计数： 细胞浓度以 5105/ml 为宜。 (7)培养细胞 将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入 37和 5CO2 的培养箱内 2-4 小时(或者 24-48 小时)后换液继续培 养培养，换液的时间由细胞情况而定。 初学者易犯错误： 1 水浴锅未预热或者未预热到 37。 2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 5，冻存细胞数量要充分，密度应达到 107m1，在融后稀释 20 倍后，仍能保 持 5105个m1 数量。 5 ， 细胞计数细胞计数 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积 悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数 目。具体操作： (1)准备工作： 取一瓶传代的细胞，按照传代细胞培养(消化法)中的传代方法 繁殖细胞，待长成单层后以被使用。 (2)细胞悬液制备： 细胞悬液的制备方法是用 0.25的胰蛋白酶液消化、PBS 液洗涤后， 加入培养液(或 Hanks 液或 PBS 等平衡盐溶液)，吹打制成待测细胞 悬液。 (3)细胞计数： 1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数 槽上。 2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸 5 滴细胞悬液到一离心管中， 加入 5 滴台盼蓝染液(0.4)或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染 液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量 悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不 要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观 察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个 大铬(每个大格含有 16 个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。 5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml ( 四个大格子细胞数/4) 2104 说明：公式中除以 4 因为计数了 4 个大格的细胞数。 公式中乘以 2 因为细胞悬液于染液是 1：1 稀释。 公式中乘以 104 因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm(长)1.0mm(宽)0.1mm(高)0.1mm3 而 1ml1000mm3 (4)细胞计数要点： 1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 104 个/ml，如果细 胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中； 2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要 注意每次取样都要混匀，以求计数准确； 4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一 个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只 计右线，不计左线。 5. *作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否 则要重新计数。 (5)初学者易犯的错误： 1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。 2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。 本实验特殊试剂的配制： 4台盼蓝母液：称取 4 克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水 至 100 毫升，用滤纸过滤，4保存。 使用液：使用时，用 PBS 稀释母液至 0.4即可。 6 用用滤滤膜膜滤滤器器过滤过滤液体除菌液体除菌 1、将滤膜放入去离子双蒸水中浸泡。用镊子取出滤膜，装入小滤器中，扭 紧后再松开一圈（不锈钢滤器螺丝不要拧太紧）。高压蒸气灭菌，其后自然干 燥。 2、使用前先拧紧小滤器，10ml 注射器接上小滤器上口，加入 2ml 待滤液 体，推上针芯，并保留数毫升气体。推压针芯，液体滤尽后，继续适当用力推 压，针芯有弹性并不能将气体推尽，则表明此滤器滤膜是安装完好的。 3、正式过滤待滤液体。滤完后再次推空气，如有阻力，表明过滤过程中滤 膜保持完好。打开小滤器，再次检查滤膜是否完好。如果发现滤膜破损，应重 新过滤。 注： 1小滤膜器使用方便，适于少量液体过滤（也可选用一次性滤器）； 2有些有机物质（如 DMSO）可溶解滤膜，因而不能使用； 3市场上有成品出售，可直接应用，但仍应在过滤前后用推注气体的方法 检测滤膜是否完好；一些大分子蛋白质可以粘在滤膜上，损失很大，可以先用 少量血清或蛋白质冲洗一下滤膜，可减少这种损失。 7，ph 对溶液的关系对溶液的关系 酚红，在 ph7.4 时，呈红色；ph 7.0，呈橘红丝；ph 6.5 呈黄色；低 于 6.5 为柠檬黄；ph7.6,呈桃红色；ph7.8 紫红色。由于颜色的判断 具有较高的主观性，因此制作一个标准色阶很必要 ph 标准色阶的制备标准色阶的制备 材料：Hanks 平衡盐溶液（HBSS)，10 倍浓缩液或粉剂，不含碳酸 盐或葡萄糖，含有 20mmol/l HEPES 9 个瓶子（大小与最长使用的培养基或培养瓶相似） ，超纯水， 灭菌的 0.1mol/l 氢氧化钠（用超纯水配制，过滤除菌） 操作步骤： 1，配制 ph6.5 的 BSS，分装至 7 个大小适宜的瓶子中。 2，使之与空气达到平衡 3，用无菌的 0.1mol/l 氢氧化钠调节 ph 至 6.8,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8 以 ph 计测定。 4，将调节好的 BSS 过滤除菌，然后存放于培养瓶中 5，保持无菌和密封。 10，培养基的更换，培养基的更换 需要更换的四个指标： （1）PH，当 ph 从 7.0 降到 6.5 时大多数细胞就停止生长；当 ph 在 6.5 和 6.0 之间时细胞开始失去活性。如果培养基从红色变成 橙色，再变成黄色，那么就需要更换培养基了。可以通过颜色变化 估计 ph 变化率，如果 ph 为 7.0 的培养物每天降低 0.1ph 单位，那 么在换液前多放置一两天没什么关系，但若培养物每天降低 0.4ph 单位，那么需要在 24-48h 内换液。 （2）细胞密度 （3）细胞类型：正常细胞如二倍体成纤维细胞在高密度时停止 分裂，此时细胞停滞在细胞周期的 G1 期，根据情况换液。 （4）形态衰退，通过长期定期观察形成经验来判断。 培养细胞时，培养基的体积与表面积比通常为 0.2-0.5ml/cm2，其最 适比例是由该细胞的需氧量决定，需氧量高的细胞在较浅的培养基 中生长较好（如 2mm） ，需氧量较低的细胞在较深的培养基中生长 较好（如 5mm） 更换培养基的无菌材料： 移液管，培养基 操作步骤： （1）准备好超净工作台，以 70%乙醇浸泡的纱布擦拭超净 工作台及实验所需的试剂及材料，并将擦拭过的试剂及材料立即放 到超净工作台。 （2）仔细观察培养物是否有污染或衰退迹象。 （3）考察上述判别是否需要更换培养基的标准，即 ph 和细 胞密度或浓度，如果需要则按下不操作。 (4)将培养物放于无菌工作区域 （5）吸除旧培养基 （6）加入同体积的新鲜培养基。最好将培养基预热至 37 摄 氏度。 （7）将培养物重新放回培养箱 注意：当培养物密度过低或生长缓慢时最好进行半量换液，即在第 5 步仅仅吸出一半旧培养基，在第 6 步补入相同体积的新鲜培养基。 即使是高密度的细胞群体，更换培养基也会刺激细胞进行有 丝分裂，因此当不需要有丝分裂时可使用维持培养基。维持培养基 是血清浓度降至 0.5%-2%或完全不加血清的常规培养基。 12，GIEMSA 染色 GIMSA 是一种多色的血涂片染料，进行血图片染色时，常与 May- Grunwald 染液结合使用，但不用于细胞的染色。染色后核呈粉红或 紫罗兰色，核仁呈蓝黑色，细胞质呈浅灰蓝色。所染细胞必须乙醇 或甲醇固定，制备过程中必须彻底脱水，否则不能正常染色。 非灭菌材料： PBSA; PBSA：甲醇（1:1） ；未稀释的 GIEMSA 染液；甲醇； 去离子水 操作步骤： 1，吸去培养基 2，用 PBSA 冲洗单层细胞，去掉冲洗液 3，加入 PBSA/甲醇液 0.2ml/cm2，静置 2min,然后去掉 PBSA/ 甲醇液 4，加新甲醇 5ml,静置 10min. 5, 弃掉甲醇液，用无水甲醇，冲洗单层细胞，去掉甲醇。 6，此时，培养瓶经干燥可储存，也可直接进行染色。即使是干 的培养瓶，用新配的无水甲醇冲洗后直接染色时非常重要的。如果 甲醇倒出，培养瓶静置了一段时间后，残留的甲醇会吸收水分，从 而妨碍下一步的染色。 7，加入纯度 GIEMSA 染液，0,。08ml/cm2,确保覆盖整层细胞。 8,2min 后，用 8ml 水稀释染液，并轻轻晃动 2min. 9,用水置换染液，游走浮渣，用自来水冲洗细胞，直到去除片 状粉色本底（沉积） ， 10，将水倒掉，用去离子水冲洗，在单层细胞仍处于湿润状态 时，用显微镜观察细胞，干燥，保存染色，观察时应重新使它湿润。 13，结晶紫染色 非灭菌材料： PBSA;PBSA/甲醇（1:1） ； 甲醇；结晶紫；过滤漏斗和滤纸， 大小适合于每个培养皿中盛载 5ml 的染液；回收染液的瓶子。 操作步骤： 1，吸去培养基 2，用 PBSA 冲洗单层细胞，弃掉冲洗液 3，每 25cm2加入 PBSA/甲醇 5ml,静置 2min,弃掉 PBSA/甲 醇 4，加入新甲醇 5ml, 静置 10min 5,弃掉甲醇，将培养皿中的液体倒干净，使其干燥 6，每 25cm2加入 5ml 结晶紫，静置 10min. 7,过滤漏斗放置在瓶上 8，将染液倒入漏斗 9，用自来水冲洗培养皿，然后用去离子水冲洗，干燥培养皿。 14，涂片制备 无菌材料：用 50%-100%血清悬浮的浓缩细胞悬液；血清 非无菌材料：显微镜载玻片；甲醇；电扇 操作步骤： 1，在载玻片一端滴一滴血清，用第二张载玻片末端蘸取这滴 血清，并在第一张载玻片上移动，在玻片表面形成一薄层血清。 2，用电扇使血清干燥 3，用 50%-100%血清悬浮细胞，细胞浓度为 106/ml,取一滴 血清滴在载玻片一端，用第二张载玻片末端蘸取这滴细胞悬液，在 第一张载玻片上移动，形成一薄层细胞的分布 4，迅速干燥载玻片，甲醇固定。 15,染色体制备染色体制备 固定阻滞在固定阻滞在 M 期的细胞，在低渗培养基中会发生膨胀，将细胞滴在期的细胞，在低渗培养基中会发生膨胀，将细胞滴在 载玻片上，染色，观察载玻片上，染色，观察 无菌材料： 对数期的培养细胞；用 PBSA 配制的 10-5mol/l 秋水仙胺； PBSA;0.25%的粗提胰蛋白酶 非灭菌材料： 低渗溶液：0.04mol/l KCL; 0.025mol/l 枸橼酸钠；醋酸甲醇固 定液；一份冰醋酸加三份无水甲醇或乙醇，新鲜配制并在冰上保存； Giemsa 染液；DPx 或 permount 封固剂；冰；离心管；巴斯德吸 管；载玻片；盖玻片#00；载玻片盒；低速离心机；涡流混悬器。 操作步骤: 1,将细胞浓度为 2 x 104 至 5 x 104/ml 的培养液 20ml 放入 75cm2的培养瓶（每平方厘米 4 x 103至 1 x104个细胞）中培养。 2，约 3-5 天后，细胞处于对数生长期，以 1：100（v:v)加入 1 x10-5mol/l 秋水仙胺（终浓度 1 x 10-7）于培养瓶内已有的培养基 中。 3,4-6h 后，轻轻去掉培养基，加 5ml 0.25% 胰蛋白酶，孵育 10min. 4,胰蛋白酶西邻悬浮细胞，弃掉上清液中胰蛋白酶。 5，以 5ml 低渗溶液重新混悬细胞，37，静置 20min. 6,加入等量新鲜配制的冰冷的醋酸甲醇，不停地混合，然后以 100g 速度离心 2min 7,弃掉上清混合物，在涡流混悬器上振荡细胞团块，再慢慢边 混匀边加新制备的醋酸甲醇。 8，细胞在冰上静置 10min.以 100g 速度离心细胞 2min. 9,弃掉上清中的醋酸甲醇，在 0.2ml 的醋酸甲醇溶液中重新振 荡以混悬细胞团（例如，将试管底部置于振荡器上） ，直到细胞均匀 分散。 10，用吸管吸一滴细胞悬液到吸管尖部，从 30cm 处滴到凉的 玻片上，倾斜玻片，让流滴流下并铺开。 11，将玻片在烧杯的沸水上迅速干燥，然后用相差显微镜观察。 如果细胞均匀铺展而没有相互接触，则以同样浓度的细胞制备更多 片子。如果细胞成堆重叠出现，则稀释悬液 2-4 倍之后，再准备一 张滴液玻片。 12，进行 Giemsa 细胞染色： 将玻片浸入纯净的染液中 2min; 将染色缸放在水池中， 加入大约 10 倍体积的水，让过多的染液从玻片染色缸的顶端溢出； 玻片静置 2min;用自来水置换出其余染液，然后用自来水逐张冲洗 玻片去除染液沉淀（使玻片上呈现粉红色，不透明的外观） ；显微镜 下观察染色情况，对于满意的则将载玻片彻底干燥，用#00 盖玻片 及 DPX 或 Permount 封片。 1616，清洁培养箱，清洁培养箱 非灭菌材料 水中含有 2%新吉尔灭或类似的真菌抑制剂，将上述水溶液注 入水盘中；替代的 CO2 温箱或塑料盒和封口的胶带；去污剂（10%新 吉尔灭或另一种灭菌去污剂，70%乙醇） 操作步骤： 1，将全部培养物移至另一个二氧化碳温箱；或包装培养物， 并通 CO2，然后将其放置在普通培养基或温室中。 2，将准备清洁的温箱断开电源 3，将温箱中所有的隔板及水盘和可拆卸的部件取出 4，用含有去污剂的溶液清洗温箱内部，尽可能擦抹每个角落 及缝隙处 5，用清水冲洗 6，用 70%乙醇擦洗温箱内部 7，在保持门打开的状态下，加热（不是加 CO2）直至温箱干 燥。 8，用去污剂擦洗隔板及各部件，然后用清水冲洗，用 70%乙 醇擦洗 9，将隔板及各种部件放回温箱中 10，放回水盘，注入含有 2%新吉尔灭的水 11，关门和接通 CO2 气体 12，当温度和 CO2 已趋于稳定，将培养物放回温箱。 17 细胞培养的疑难解析细胞培养的疑难解析 1，培养基的培养基的 ph 值变化迅速：值变化迅速： （1） CO2 分压设置错误：应根据培养基中碳酸氢钠的浓度降低 或升高培养箱中 CO2 分压，当碳酸氢钠的浓度在 2.0- 3.7g/l，应相应的使用 5%至 10%的二氧化碳分压。 （2） 组织培养瓶盖的过紧：应将盖子悬松 1/4 圈。 （3） 碳酸氢盐的缓冲能力不足：应加入 HEPES 缓冲液，使其 最 终浓度为 10-25mM (4)细菌、酵母或真菌污染 2，细胞无法在培养器皿上贴壁 （1） 胰蛋白酶消化过度：应缩短胰蛋白酶的消化时间，或者减 少用量 （2） 支原体污染：隔离培养物，检测其是否感染支原体，清除 通风橱和培养箱。 (3)培养基中无附着因子。 3，悬浮细胞聚集在一起： （1） 存在钙离子和镁离子：用不含钙离子和镁离子的平衡盐溶 液冲洗细胞。轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。 （2） 支原体污染：隔离培养物，检测其是否感染支原体。清除 通风橱和培养箱。如果培养物被污染，则丢弃。 （3） 蛋白酶消化过度，细胞裂解释放 DNA. 4，原代细胞培养被污染; (1) 残留的原代组织将培养物污染：培养前，用含有较高浓度 抗生素和抗真菌剂的平衡盐溶液清洗组织碎片数次。 5，培养物生长缓慢： （1） 培养基或血清改变：比较不同培养基配方中葡萄糖和氨基 酸及其他成分有无差异；通过生长实验比较新老批次血清 有无差异；增大细胞初始接种密度。 （2） 必需生长促进成分（如：L-谷氨酰胺或生长因子）耗竭， 缺乏或分解：去除原培养基加入新培养基。 （3） 轻度细菌或真菌污染：在不加抗生素的条件下进行培养， 如果污染物被污染，则丢弃。 （4） 试剂储存不当：血清应在-5至-20下储存。完全培养 基应在 2到 8下避光储存，最长可使用两周。尽量减 少血清和培养基见光时间。 （5） 细胞初始接种密度过低。或有限培养物衰老。 （6） 支原体污染。 6，培养物死亡 （1） 培养箱中无二氧化碳：检测培养箱中二氧化碳使用速度， 以便确定何时更换气瓶。经常检查管路连接处是否漏气， 不要频繁开启培养箱门。 （2） 培养箱中温度有波动。 （3） 抗生素浓度过大，培养基的渗透压不合适。 7，细胞污染应对： 培养细胞一经污染，多数较难处理。如