紫外分光光度法标准操作规程

标准操作规程 标 题：紫外分光光度法标准操作规程 生效日期 年 月 日 页次： 1/7 编号：SOPQC05701颁发部门：质量管理部 新订 修订 原文件号： 编制：部门审核：QA 审核：批准： 分发部门： QC。 目的：建立一个紫外分光光度法标准操作规程，以便正确操作仪器， 保护仪器。 范围：适用于所有紫外分光光度计。 责任者：QC 主任，QC 化验员 规程： 1. 简述：紫外分光光度计是通过被测物质在紫外光区的特定波长 处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方 法。本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。定量 分析通常选择物质的最大吸收波长处测定吸收度，然后用对照品或百 分吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知 物质定性可用吸收峰波长或吸收度比值作为鉴别方法；若化合物本身 在紫外光区无吸收，而杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的 吸收峰处化合物无吸收，则可用本法作杂质检查。物质对紫外辐射的 吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生的，因此紫外吸收主要 决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分子 结构中如含有共轭体系、芳香环或发色基团，均可在近紫外区 （200400nm）或可见光区（400850nm）产生吸收。通常使用的 紫外分光光度计的工作波长范围为 190900nm，因此又称紫外-可见 分光光度计。 紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。朗伯-比尔 （LambertBeer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分 析的依据，其数学表达式为： ECL T A 1 lg 式中 A 为吸收度； T 为透光率 E 为吸收系数 标准操作规程 标 题 紫外分光光度法标准操作规程 颁发部 门 质量管理 部 编号SOPQC05701页次：2/7 C 为溶液浓度 L 为光路长度 如溶液的浓度（）为 1%（g/ml）,光路长度为（）为 1cm,相 应的吸收系数为百分吸收系数，以表示。如溶液的浓度（）为 %1 1cm E 摩尔浓度(mol/L),光路长度为 1cm 时，则相应有吸收系数为摩尔吸收 系数，以 表示。 2. 仪器：紫外分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、 记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。 为了满足紫外-可见光区全波长范围的测定，仪器备有二种光源， 即氘灯和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。 单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件、聚 焦透镜或反射镜等组成。色散元件有棱镜和光栅二种，棱镜多用天然 石英或熔融硅石制成，对 200400nm 波长光的色散能力很强，对 600nm 以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀排光 谱。光栅系将反射或透射光经衍射而达到色散作用，故常称为衍射光 栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故为匀排光谱，双光束仪器多用 光栅为色散元件。 检测器有光电管和光电倍增管二种。 紫外分光光度计依据其结构和测量操作方式的不同可分为单光束 和双光束分光光度计二类。单光束分光光度计有些仍为手工操作，即 固定在某一波长，分别测量比较空白、样品或参比的透光率或吸收度， 操作比较费时，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但适用于单波长的 含量测定。双光束分光光度计借扇形镜交替切换光路使分成样品 （S）和参比（R）两光束，并先后到达检测器，检测器信号经调制分 离成两光路对应信号，信号的比值可直接用记录仪记录，双光束分光 光度计操作简单，测量快速，自动化程度高，但作含量测定时，为求 XXXX 制药股份有限公司 准确起见，仍宜用固定波长测量方式。 3. 紫外分光光度计的检定 3.1. 波长准确度 3.1.1. 波长准确度的允差范围 双光束光栅型紫外-可见分光光度 计波长准确度允许误差为0.5nm。单光束棱镜型 350nm 处 0.7nm,500nm 处2.0nm，700nm 处4.8nm。 标准操作规程 标 题 紫外分光光度法标准操作规程 颁发部 门 质量管理 部 编号SOPQC05701页次：3/7 3.1.2. 波长准确度检定方法 3.1.2.1. 用低压汞灯检定 关闭仪器光源，将汞灯（用笔式汞灯 最方便）直接对准进光狭缝，如为双光束仪器，用单光束能量测定方 式，采用波长扫描方式，扫描速度“慢” （如 15nm/min） 、响应“快” 、 最小狭缝宽度（如 0.1nm） 、量程 0100%，在 200800nm 范围内单 方向重复扫描 3 次，由仪器识别记录各峰值（若仪器无“峰检测”功 能，必要时可对指定波长进行“单峰”扫描） 。单光束仪器以 751G 型 为例，可将选择开关放在0.1 位置，透光率读数放在 100（或选择开 关放在1，透光率放在 10） ，关小狭缝，打开光闸门，缓缓转动波长 盘，寻找汞灯 546.07nm 峰出现的位置，若与波长读数不符，应调节 仪器左侧准直镜的波长调整螺丝，如波长向短波长方向移动，应顺时 针方向旋转波长调整螺丝，如向长波长方向移动，则应反时针方向旋 转波长调整螺丝，调整好后，再按汞灯的下列谱线测试，记录每条谱 线与仪器波长读数的误差。 用于检定紫外-可见分光光度计的汞灯谱线波长： 237.83，253.65，275.28，296.73，302.15，313.16，334.15，365.02， 365.48，366.33，404.66（紫色） ，435.83（蓝色） ，546.07（绿色） ， 576.96（黄色）及 579.07nm。 3.1.2.2. 用仪器固有的氘灯检定 本法主要用于日常工作中波长准 确度的核对。取单光束能量测定方式，测量条件同上述低压汞灯的方 法，对 486.02 及 656.10nm 二单峰进行单方向重复扫描 3 次。 3.1.2.3. 用氧化钬玻璃检定 将氧化钬玻璃放入样品光路，参比 光路为空气，按测定吸收光谱图方法测定。校正自动记录仪器时，应 考虑记录仪的时间常数，测定样品与校正时取同一扫描速度。 氧化钬玻璃在 279.4，287.5，333.7，360.9，418.7，460.0，484.5，536.2 及 637.5nm 波长处有尖锐的吸收峰，可供波长检定用。氧化钬玻璃因制造的原因， 每片氧化钬的吸收峰波长有差异，应使用经计量部门校验过的。 3.1.2.4. 用高氯酸钾溶液检定 本法可供没有单光束测定功能的 双光束紫外分光光度计波长准确度检定用。高氯酸钾溶液的配制方法： 取 10%高氯酸为溶剂，加入氧化钬（HO2O3）配成 4%溶液即得。 高氯酸钾溶液较强的吸收峰波长为 241.13，278.10，287.18，333.44，345.47，361.31，416.28，451.30， 485.29，536.64，640.52nm。 标准操作规程 标 题 紫外分光光度法标准操作规程 颁发部 门 质量管理 部 编 号 SOPQC05701页次：4/7 如果是双光束扫描仪器，但不是数据贮存型的（指是直接将信号 描记于记录纸上） ，记录的波长可能因记录笔滞后而非真实波长，为 了准确测定，建议采用定点检定而不用扫描方式。 3.2. 吸收度准确度 精密称取在 120干燥至恒重的基准重铬酸 钾约 60mg，置 1000ml 量瓶中，用硫酸液（0.005mol/L）溶解并稀释 至 1000ml，用配对的 1cm 石英池，以硫酸液（0.005mol/L）为空白， 在 235，257，313，350nm 分别测定吸收度，然后换算成,，测得 %1 1cm E 值应符合下表中规定的允差范围（1%） 。国际药典规定的允差为 1%。 分光分度法允差范围 波长 （nm） 吸收强度 吸收系数（ ） 1% 1cm 允差范围 235 257 313 350 最小 最大 最小 最大 124.5 144.0 48.62 106.6 123.3125.7 142.6145.4 48.1349.11 105.5107.7 分辨率、杂散光、基线平直度、稳定度、绝缘电阻等项检定，按 XXXX 制药股份有限公司 中华人民共和国国家计量检定规程 JJG682-90双光束紫外可见分光 光度计检定规程执行，并应符合有关项下的规定。日常常规测定主 要是对以上两项时常检查。 4. 样品测定操作方法 4.1. 吸收系数测定（性状项下）按各该品种项下规定的方法配制 供试品溶液，在规定的波长（参见 5.8 项）测定其吸收度，并计算吸 收系数，应符合规定范围。 4.2. 鉴别及检查按各该品种项下的规定，测定供试品溶液在有关 波长处的最大及最小吸收，有的并须测定其各最大吸收峰或最大吸收 与最小吸收的比值，均应符合规定。 4.3. 含量测定 4.3.1. 对照品比较法按各该品种项下规定的方法，分别配制供试 品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品中 被测成分标示量的（10010）%以内，用同一溶剂，在规定的波长处 测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度。 标准操作规程 标 题 紫外分光光度法标准操作规程 颁发部 门 质量管理 部 编 号 SOPQC05701页次：5/7 4.3.2. 吸收系数法按各该品种项下配制供试品溶液，在规定的波 长及该波长+1nm 处测定其吸收度，按各该品种在规定条件下给出的 吸收系数计算含量。 采用吸收系数法应对仪器进行校正后测定，如为测定新品种的吸 收系数，需按“吸收系数测定法”的规定进行。.计算分光光 度法采用计算分光光度法的品种，应严格按各该品种项下规定的方法 进行，用本法时应注意：有一些吸收度是在供试品或其成分吸收曲线 的上升或下降陡坡部处测定，影响精度的因素较多，故应仔细操作， 尽量使测定供试品和对照品的条件一致，若该品种不用对照品，如维 生素测定法（见中国药典附录） ，则应在测定前对仪器作仔细的校 正和检定。 5. 注意事项 5.1. 试验中所用的量瓶，移液管均应经检定校正、洗净后使用。 5.2. 使用的石英吸收池必须洁净。用于盛装样品、参比及空白溶 液的吸收池，当装入同一溶剂时，在规定波长测定吸收池的透光率， 如透光率相差在 0.3%以下者可配对使用，否则必须加以校正。 5.3. 取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧。装盛样品溶液以池体 积的 4/5 为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而 下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留在池子 的透光面，可先用醮有空白溶剂的擦镜纸拭净。吸收池放入样品室时 应注意每次放入方向相同。使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干防尘保 存，吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸（3:1V/V）混合液稍 加浸泡后，洗净备用。如用铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁 液中长时间浸泡，否则清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表 面，并应充分用水冲洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。 5.4. 测定前应先检查所用的溶剂在测定供试品所用的波长附近是 否符合要求，可用 1cm 石英吸收池盛溶剂以空气为空白（即参比光路 中不放置任何物质）测定其吸收度，应符合下表规定。 以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸收度的规定 波长范围 （nm） 吸收度 220 240 0.4 241250 0.2 251 300 0.1 300 以 上 0.05 所用溶剂应不超过其截止使用波长，每次测定时应采用同一厂牌 批号， 标准操作规程 标 题 紫外分光光度法标准操作规程 颁发部 门 质量管理 部 编 号 SOPQC05701页次：6/7 混合均匀的批溶剂。 5.5. 称量应按药典规定要求。配制测定溶液时稀释转移次数应尽 可能少，转移稀释时所取容积一般应不少于 5ml。含量测定供试品应 称取份，如为对照品比较法，对照品一般也应称取份。吸收系数 检查也应称取供试品份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在 +0.5%以内。作鉴别或检查可取样品份。 5.6. 供试品测试溶液的浓度，除各该品种项下已有注明者外，供 试品溶液的吸收度以在 0.3-0.7 之间为宜，吸收度读数在此范围误差较 小，并应结合所用仪器吸收度线性范围，配制合适的读数浓度。 XXXX 制药股份有限公司 5.7. 选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否 则测得的吸收度值会偏低，狭缝宽度的选择应以减小狭缝宽度时供试 品的吸收度不再增加为准，对于中国药典紫外测定的大部分品种，可 以使用 2nm 缝宽，但对某些品种如青霉素钾及钠的吸收度检查则需用 1nm 缝宽或更窄，否则其 264nm 的吸收度会偏低。 5.8. 测定时除另有规定者外，应在规定的吸收峰+2nm 处，再测几 点的吸收度，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸收度最大 的波长作为测定波长，除另有规定外吸收度最大波长应在该品种项下 规定的波长+1nm 以内否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长 的准确度。 6. 结果计算 6.1. 对照品比较法可根据供试品及对照品溶液的吸收度与对照品 溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。 样品：对照样品：对照 样品样品对照对照 式中为吸收度值；为测试液浓度（以 mg/ml 计） 6.2. 吸收系数法中国药典规定的吸收系数，系指，即在指定 %1 1cm E 波长时，光路长度为 1cm，试样浓度换算为 1%（g/ml）时的吸收度 值，故应先求出被测样品的值，再与规定的值比较，可计算出 %1 1cm E %1 1cm E 供试品的含量。 Cl A E cm %1 1 标准操作规程 标 题 紫外分光光度法标准操作规程 颁发部 门 质量管理 部 编 号 SOPQC05701页次：7/7 式中为供试品溶液测得的吸收度值； C 为供试品溶液的百分浓度，即 100ml 中所含溶质的克数 （g/ml） ； L 为吸收池的光路长度（cm） 。 %100 )( )( % %1 1 %1 1 标准 样品 供试品的含量 cm cm E E 式中：为根据前式计算出的供试品的百分吸收系数； %1 )