结核杆菌研究进展(综述)

结核杆菌 DNA 疫苗研究进展 结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患传染病。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计，全世界约有 20 亿人感染过结核分枝杆菌，每年约有 200300 万人死于结核病，其人数是其他传染病死亡人数的总和。20 世纪末，结核病仍 然是全球感染和传染病的第一“杀手” 。当前唯一可用的疫苗-卡介苗（BacilleCalmette Guerin，BCG）的免疫效果下降，对其保护效果也存在争议，经试验证明其总有效率仅为 50 %。而且对成年人的免疫效果也不明确，因此现在急需研制出新型疫苗。目前新型结核 疫苗研制方向主要有：减毒结核疫苗，高表达重组疫苗，蛋白质亚单位疫苗和 DNA 疫苗 （又称核酸疫苗或基因疫苗）等四种。本文就结核 DNA 疫苗的新进展作一简要综述。 1 DNA 疫苗的作用机理 DNA 疫苗的作用机理是能让外源基因在真核细胞内表达，表达出来的蛋白质和 MHC- 类分子结合后被呈递到细胞的表面，再被 CD8+T 淋巴细胞的受体识别而诱发 CTL 的细胞 毒反应，这对细胞内寄生的结核杆菌有很强的杀伤作用。但目前对 DNA 疫苗激活免疫系 统的详细机理还不是很清楚，不过有以下几种机制可对此进行解释：DNA 疫苗直接致 敏体细胞；基因疫苗转染 APC（抗原递呈细胞-巨噬细胞或树突状细胞） ；核酸疫苗在 APC 内表达的蛋白质抗原作为“内源性抗原” ，结合 MHC-类分子后被 T 细胞受体识别， 这是诱导细胞毒 T 细胞的最有效的途径；交叉致敏；细菌质粒具有免疫佐剂功能1。 当人或小鼠感染结核菌后，巨噬细胞（M）吞噬结核菌但却不能将其杀灭。因此结核菌 在 M 中生存繁殖，外来药物与抗体也无法直接消除结核菌。只有人 M 被抗原特异的 细胞毒性 T 细胞溶解后，其中寄生的毒性结核菌才能被杀死。因此可以设想，杀菌性 T 细胞的功能低下导致了小鼠感染结核菌后免疫抵抗力的下降，造成慢性感染，在人体也可 发生类似情况。在主动免疫的机制中，可溶性蛋白抗原主要刺激 CD4+T 细胞反应，而 DNA 疫苗则可引起强烈的 CD8+T 细胞反应，诱导产生大量的抗原特异性 CD8+/ CD4- / CD44 high T 细胞，分泌 IFN-2，引起有效的细胞免疫。 2 编码抗原基因重组的 DNA 疫苗 1996 年 8 月出版的自然医学杂志同时刊登了 Huygen 和 Tascon 两位博士各自分别 完成的结核病 DNA 疫苗的论文，1998 年英国剑桥 Sanger 中心完成结核杆菌基因组序 列的测定，为结核 DNA 疫苗的研制提供了保证，使其研制进入飞跃发展阶段。实验证明 结核杆菌在体外培养早期分泌的蛋白质是主要的抗结核保护性抗原，因此主要的结核 DNA 疫苗都是将编码这些抗原的基因克隆到载体中构建而成的。目前结核 DNA 疫苗的研制主 要有：以 Antigen85 和 hsp65，以及结核杆菌培养过滤液中的分泌蛋白 ESAT-6 和 MPT-64 编码基因重组的 DNA 疫苗3。 2. 1 以 Antigen85 编码基因构建的 DNA 疫苗 在结核菌和 BCG 的培养滤液中分泌蛋白的一个主要成分是 Ag85 复合体（Antigen85 complex） ，由 Ag85A，Ag85B，Ag85C 组成的 3032kD 蛋白家族，分别由三种不同 但高度同源的基因编码。在感染结核或麻风菌与卡介苗免疫的小鼠及人体上，Ag85 复合 体不仅可以刺激产生体液免疫，尚可激发较强 Th1 型细胞免疫，引起 CD8+ T 细胞增殖 和 IL-2 及 IFN- 等细胞因子水平的上升。结核病的免疫学特征表现为细胞免疫功能低下， 研究结果显示 CD8+T 细胞的保护功能可能与 IFN- 诱导有关，这些实验揭示可利用 Ag85 复合体基因构建 DNA 疫苗。其中 Ag85A 和 Ag85B 被认为更有效，一些实验已 证实，由 Ag85A 和 Ag85B 编码的 DNA 疫苗对小鼠抵抗由呼吸道或静脉感染的结核菌 有保护作用4，目前一些研究小组正在致力于此方面的研究。 2. 1. 1 Ag85A 用含结核菌 38kD 蛋白基因与 Ag85A 及 HSP65 编码基因构建的 DNA 疫苗免疫的动物 模型中，可产生很好的免疫保护作用。以人工合成的包括 Ag85A 全部 20 肽刺激小鼠脾 细胞分泌 IL-2，IFN- 为指标，发现 DNA 免疫诱导产生的 T 细胞反应在强度和广度上均 比皮下注射结核菌感染的效果好，CTL 活性也上升。编码 Ag85A 的 DNA 疫苗与 BCG 有同样的诱导保护作用。 Huygen 把结核杆菌的抗原 85A 基因克隆到美国 Merk 公司的 VIJ 载体中构建了 DNA 疫 苗，然后将 DNA 在体外转染肌肉瘤细胞，证明了 DNA 疫苗能够在真核细胞中表达结核 杆菌的抗原 85A 蛋白质。给 Balb/c 和 C57BL/6 小鼠肌肉注射 Ag85A 疫苗，能在小鼠体 内诱发很强的体液和细胞免疫反应。 2. 1. 2 Ag85B 由 MTB （Mycobacterium tuberculosis）H37Rv 基因组编码，用其作为亚单位疫苗与 多个蛋白疫苗比较或与其他基因疫苗比较4，均表明 Ag85B 是 MTB 较好的保护性靶抗 原之一。研究表明 Ag85B 基因免疫小鼠可以产生较高水平的 IFN- 和脾淋巴细胞显著增 殖为特征的细胞免疫反应。将此小鼠的 T 细胞过继免疫给正常小鼠后，对 MTB 毒株的感 染有一定的保护性5。相继用编码 Ag85B 的 DNA 疫苗和卡介苗免疫，其对抵抗结核杆 菌的感染比单独用卡介苗更为有效6。Li 和 Kamath 各自分别将 Ag85B 基因克隆到 pJM4303 载体中，用于免疫 C57BL/6 小鼠，都获得了明显的特异性体液和细胞免疫反应。 在用气雾攻击结核杆菌 H37Rv 毒菌后，均获得了接近 BCG 的免疫保护力。 2. 1. 3 Ag85C 对于 Ag85C 基因重组的 DNA 疫苗，目前发现其效果远远不及 85A 和 85B 。也有研究 人员对此进行对比研究7。有学者发现7利用 tPA（ Tissue plasminogen acti 2vator 组织纤维蛋白溶酶原激活因子）信号序列为增强子可使编码 85A，85B 和 ESAT-6 的重 组疫苗高水平表达，而 Ag85C 编码基因重组的 DNA 疫苗却没有明显效果。Ag85 基因 重组疫苗免疫过的小鼠中，受 tPA 免疫的小鼠脾细胞产生的 IL-2， IFN- 大大增加，利 用 tPA 信号序列可增强 Ag85 基因重组疫苗的免疫原性，这为将来的疫苗设计起到重要 启示。 2. 2 以 hsp65 编码基因构建的 DNA 疫苗 hsp65（ Heat shock protein65）是由 HLA 2 DR 和 2 DQ 复合基因编码的 65kD 蛋白。据 Tascon 等人报道，表达麻风分枝杆菌 hsp65 的重组质 粒有与 BCG 相似的抗结核作用。以 hsp 2 65 编码基因构建的 DNA 疫苗可诱导产生大 量的 IFN-，使 T 细胞转化为 CD8+ / CD44 hi T 细胞。将其接种后至 8 个月保护性 T 细胞数量和免疫水平持续上升， 15 月后逐渐下降8。在免疫后 8 15 月，CTL 仍有 作用。而与此对照，接种卡介苗，产生 IFN- 诱导 T 细胞转化为 CD4+ /CD44 lo T 细胞， 在过继转移实验中 CD4+ /CD44 lo T 细胞被证实没有免疫保护作用，而 CD8+ /CD44 hi T 细胞才具有保护作用，因此接种 DNA 疫苗的小鼠比接种卡介苗的小鼠更易受到保护。 用全长的 Mhsp65 编码的 DNA 疫苗可以诱导特异性 MHC-和型 T 细胞反应9。因 此在 MHC -CTL 细胞介导的抗结核免疫反应中 Mhsp65（9369 ）有着广阔研究前景， 甚至可考虑用其来诱导免疫保护以抵抗更为广泛的各种病原体。 2. 3 以 ESAT-6 编码基因构建的 DNA 疫苗 ESAT-6 是由结核分枝杆菌（ M. t uberculosis）毒株和牛型分枝杆菌（ M. bovis）毒 株分泌的低分子量 T 细胞抗原。它是结核杆菌早期分泌性蛋白质中诱导 T 细胞免疫反应能 力最强的蛋白质。能有效刺激病人外周血中 CD4+ T 细胞增殖和诱导 IFN- 产生。在小鼠 感染模型中， ESAT-6 特异性 T 细胞主要是 CD45RBlowCD44highLFA-IhighL 2selectinlowCD4+ T 细胞（可能是一种长效记忆性 T 细胞） ，它较易分泌 IFN-10。 敲除 ESAT6 基因能够导致结核杆菌失去毒性，因此可从牛型结核杆菌中获得活菌疫苗， 并能应用于鉴别小鼠是疫苗免疫还是结核感染11。因为试验中接种敲除 ESAT-6 基因的 变异结核菌株和接种毒型结核菌株的小鼠都对 PPD 阳性，而只有后者对 ESAT-6 试验阳 性。研究表明肌注单独由编码 ESAT-6 的 DNA 疫苗难以取得理想效果4，因为 ESAT-6 不是很强的免疫原。Kamath 4等认为编码 ESAT-6DNA 疫苗的保护作用比 MPT64 强， 但这两种 DNA 疫苗的保护作用并未超过 BCG，所以需要加入其它免疫刺激源，如细胞因 子，才能取得良好效果。 Li 等在构建 ESAT6 DNA 疫苗时，对能表达信号肽和不能表达信号肽的 DNA 疫苗进行了 比较。结果表明，这两种 ESAT6 DNA 疫苗的免疫保护力都很高，而且试验的重复性很好。 2. 4 以 MPT 编码基因重组的 DNA 疫苗 MPT-64 是结核菌生长过程中的分泌性蛋白，也是重要的 T 细胞抗原，能诱发结核菌感 染的豚鼠发生很强的 DTH 反应。1999 年 Kamath 等首次将结核分枝杆菌的 MPT-64 蛋白编码基因经骨骼肌注射免疫 C57BL/ 6 小鼠，第一次免疫后 2 周即可产生特异性抗体， 每间隔 3 周免疫一次，共 3 次，免疫过程中血清中特异性抗体滴度逐渐增高。目前设想 MPT-64 主要诱导细胞免疫应答，体液免疫应答不是其主要反应，这需进一步研究其细胞 免疫应答加以证实。国内有研究认为，结核分枝杆菌 MPT-64 DNA 疫苗经肌肉注射免疫 小鼠只能诱导部分小鼠产生特异的体液免疫应答，免疫效果存在明显个体差异12。部分 BCG 在减毒的过程中丢失了编码 MPT64 的基因，可用 MPT64 代替 PPD 作为皮试试剂， 且其特异性较强，因此可以鉴别小鼠是用 BCG 免疫过还是结核感染。 MPT-63 蛋白质也有很强的刺激 T 淋巴细胞免疫反应的能力。Li 等将 MPT-63 基因克隆到 pJW4303 载体中构建的 DNA 疫苗也显示了较好的免疫保护效果；但是还需要进一步证明 其免疫保护力的重复性。 2. 5 其他编码抗原基因构建的 DNA 疫苗 目前对结核杆菌其他成分及其 DNA 疫苗免疫效果的研究仍在深入进行。DNA 疫苗编码 的蛋白还有 38kD 蛋白， hsp70 和 36 与 6kD 蛋白。PstS-1，PstS-2，PstS-3 蛋白免 疫小鼠可以刺激特异性抗体产生（lgG） ，并刺激生成 Th1 型细胞因子 IL 2 1 和 IFN- 。PstS-1 DNA 免疫不能激发细胞免疫应答，PstS-2 DNA 免疫仅可引起中等水平的应答。 而 PstS- DNA 免疫可产生高水平的应答13。目前一个主要障碍是还没有准确分离出结 核菌的保护性抗原，但在小鼠和豚鼠实验中证实，结核菌的分泌性抗原和表面抗原比胞质 抗原更易引起保护性反应，控制结核菌的复制13。因此将在这些抗原中进行更深一步的 研究，寻找新型 DNA 疫苗。 3 应用前景的展望 结核 DNA 疫苗的研究历史虽然很短，但是在小动物的试验研究结果还是十分令人鼓舞的 4。目前的研究重点还是在筛选不同的结核杆菌基因，然后在初步筛选出来的候选者中， 进一步在豚鼠实验中进行验证和精选。由于豚鼠是结核杆菌的敏感动物，因而攻击后脏器 中的活菌数可能在免疫组和对照组之间差异不大，但是以组织的病理改变作为指标，则可 以显示出 DNA 疫苗的免疫保护效果。在众多结核 DNA 疫苗的动物实验中，很少能够在 动物试验中具有 BCG 同样的，甚至超过 BCG 的免疫保护力。例如：Carl G. Feng 发现单 独用编码 Ag85B 的 DNA 疫苗免疫，其减少菌落数效果不如 BCG 6。但如果接着接种 BCG，其免疫效果就会显著提高，脾中菌落数下降到 1/ 100，而单独用 BCG 只能下降到 1/ 10 。因为对 DNA 疫苗致敏的 TB 特异性 CD8+ T 细胞，BCG 能起到放大其功效作用， 还能极大提高 Th1 型 CD4 +T 细胞反应，而后者是抵御 MTB 的关键。通过单独免疫去 筛选保护力强的 DNA 疫苗，然后加入合适的促进剂，将会使其免疫效果大大增强。组成 联合疫苗未来结核菌 DNA 疫苗的研究方向。DNA 疫苗不仅可以预防感染，还有治疗作 用。给严重感染的小鼠接种 DNA 疫苗，小鼠免疫系统就能从原来的抑制状态转换到杀灭 滞留结核杆菌的状态。不仅可以防止形成持续感染，还可以使已经形成的持续感染得到清 除2。可以展望将这种基因治疗与传统的化疗结合起来可能会更好更快地治疗人类的结核 病。DNA 疫苗可引起细胞免疫和体液免疫，这不仅仅取决于抗原的性质，还与 DNA 疫 苗的接种途径（如肌肉注射或基因枪注射） ，接种量密切相关。基因免疫中引起细胞免疫应 答比引起体液免疫应答所需要的抗原量要少，即以低剂量接种时较易引起细胞免疫应答； 高剂量接种时则体液免疫应答占优势。因此可利用 DNA 疫苗接种的量来影响免疫应答的 类型。 为了增强结核 DNA 疫苗的免疫保护效果，目前有如下几个研究方向：多价疫苗；免疫调 节因子；加速抗原的降解；鼻内接种途径。未来的 DNA 疫苗关键是要在诱导 INF- 的分 泌和 CD8+ T 细胞产生，以引起有效的细胞免疫。利用编码多肽的 DNA 疫苗将可能提高 抵抗各种疾病的疫苗的效果，选择合适的结核菌蛋白编码基因和改造载体以增加 DNA 疫 苗的表达水平，制定完善的免疫策略和途径、插入免疫调控序列和开发新型佐剂增强免疫 应答、提高 DNA 疫苗的安全性等是今后研究的重点。 参考文献 1. 廖国阳.基因免疫机理及安全性研究进展J.国外医学免疫学分册 2001,24:309-312. 2. Douglas B , Celio L. Enhancement of immunocompetence in tuberculosis by DNA vaccinationJ. 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