线粒体功能障碍与人体疾病的研究进展

兰州交通大学化学与生物工程学院 综合能力训练文献综述 题目：线粒体疾病的最新研究进展线粒体疾病的最新研究进展 作者：朱刚刚 学号：201207730 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16 线粒体疾病的最新研究进展线粒体疾病的最新研究进展 摘要：本文为了对线粒体疾病研究的最新进展进行论述，分别从线粒体功能障 碍、线粒体疾病、以及相关线粒体疾病的治疗与干预策略三个方面进行了综述。 重点从线粒体的功能障碍进行了介绍。 关键词：线粒体、线粒体 tDNA、线粒体疾病。 引言：线粒体疾病主要是指由于线粒体 DNA 突变所导致的一类疾病。 有许多人类疾病的发生与线粒体功能缺陷相关,如线粒体肌病和脑肌病、线粒体 眼病,老年性痴呆、帕金森病、O 型糖尿病、心肌病及衰老等,有人统称为线粒体 疾病。线粒体疾病的发生被认为与氧化磷酸化过程相关基因的突变有关。 一、 线粒体功能障碍 1 线粒体结构、基因组特征及主要功能 1.1 线粒体结构及基因组特征 电镜下的线粒体是由两层单位膜套叠而 成的封闭囊状结构，从外向内依次分为外膜、膜间隙、内膜、基质。不同于经 典的“隔舱板”理论，最新提出的三维重构模型认为: (1)外膜与内质网或细胞 骨架连接形成网络；(2)内外膜间随机分布横跨两端，宽 20nm 的接触点；(3) 内膜通过界面与嵴膜接口部分相连，并不直接向内延伸形成嵴膜；(4)嵴膜非 “隔舱板”式而是管状或扁平状，相互间可连接或融合，呈现不同的形式。执 行线粒体功能的生物大分子分布在不同的空间：外膜上有 Bcl-2 家族蛋白、膜 孔蛋白以及离子通道蛋白；内膜中有电子传递链(呼吸链)复合物 IIV 和复合物 V(ATP 合成酶); 膜间隙和嵴膜腔分布着细胞色素 C、凋亡诱导因子(apoptosis in-ducing factor，AIF)和 Procaspase 2、3、9 及其他酶蛋白；电压依赖性阴离 子通道(VDAC)、ADP/ATP 转换蛋白(ANT)和线粒体膜转运孔(mitochondrialper- meabletransition pore，MPTP)存在于接触点；三羧酸循环(TCA cycle)酶系、存 储钙离子的致密颗粒及线粒体基因组则包含于基质中。【1】与核基因组(nDNA) 不同，mtDNA 结构简单，仅含 16 569 个碱基，编码 2 种 rRNA、22 种 tRNA 和 13 种参与呼吸链形成的多肽。通常裸露且不含内含子，既缺乏组蛋白保护和 完善的自我修复系统，又靠近内膜呼吸链，极易受环境影响，突变频率比 nDNA 高 1020 倍。 1.2 线粒体功能 作为糖、脂肪、氨基酸最终氧化释能的场所，线粒体的 主要功能是进行氧化磷酸化、合成 ATP，为生命活动提供直接能量。除此以外， 它还扮演着多种角色，其中之一是充当“钙库”，参与细胞内钙离子的信号传 导。研究发现，一旦感受到周围形成的钙微区(calciummicrodomain)，线粒体 可以利用呼吸代谢时产生的电化学梯度，通过膜上协同转运体将钙摄入基质， 然后以磷酸钙的形式储存在一些较大的致密颗粒中。【2】已经积累的 Ca2+又可 以通过钠钙交换系统(2Na+/Ca2+exchanger，NCE)和大分子 MPTP 转运孔道 再次释放到胞质，从而调节胞浆中钙离子的动态平衡，影响细胞内许多相关的 生理活动，如信号传导、能量代谢和细胞凋亡。线粒体参与了细胞凋亡。研究 发现，在典型的凋亡特征，如染色质浓缩、D N A 碎片( D N Aladder)、凋亡小 体等出现以前，线粒体已经发生跨膜电位丧失、外膜通透性增加、膜间隙蛋白 释放等重大变化。 细胞色素 C 是诱发凋亡的重要信号分子，它是相对分子量为 1.45104Da 的水 溶性蛋白，一般分散在膜间隙靠近内膜面，不能通过外膜。凋亡发生时释放到 胞质，在 ATP/dATP 的参与下，与 Apaf-1(apoptoticproteaseactivatingfactors) 结合形成寡聚体(Apoptosome)，Apaf-1 再通过其氨基端与 Caspase-9 的功能 前端相互作用，导致 Caspase-3 活化并进一步激活下游的 Caspases。此外，还 有一种不依赖于 Caspase 的凋亡诱导因子(AIF)，是分子量为 5.7104Da 的 黄素蛋白，与细菌铁氧还原蛋白和 N A D H 氧化还原酶有高度同源性，释放后 可直接到达细胞核，激活核酸内切酶，引发凋亡。【3】目前认为，Bcl-2 家族蛋 白的调控与 MPTP 孔道的开放，是造成外膜非特异性断裂、通透性增高、凋亡 因子释放的主要原因，而氧自由基积聚、氧化应激产生，可能直接参与并诱导 了的下降和 MPTP 的开启，是构成凋亡信号传导的早期事件。线粒体既是自由 基的攻击靶点，也是自由基的产生源头。胞内 95%以上的活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)来自线粒体氧化磷酸化，是分子氧接收呼吸链“漏电子” 后还原形成的副产物，包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢。它们中 20来 自复合体 I，80% 来自复合体 III，大致占呼吸态 IV 总耗氧量的 2%6%，极 易诱发氧化应激，造成细胞损伤。不过，由于具有完善的抗氧化防御体系，细 胞内多余的 ROS 总能及时被清除。已知的抗氧化系统分为酶性和非酶性两种， 包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶 (Catalase)以及谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸、亲水性(疏水性)抗氧化物质等。正 是依赖这样的防御措施，体内自由基的。【4】 2、线粒体 DNA(mtDNA)缺陷 2.1 线粒体 DNA(mtDNA)缺陷、氧化磷酸化异常及能量代谢障碍，通常能引起 细胞结构、功能发生一系列渐进性，甚至不可逆性的病理改变，在脑组织中影 响尤为明显，因为大脑虽然重量仅占身体总重的 2%，但对氧的消耗量却要占 到身体总消耗量的 25%哺乳动物 mt tNA 有 3 种常见的非典型二级结构( Fig 1) 绝大多数 tNA 具有高度保守的三叶草结构( Fig 1 A，0 型) 【5】 在环和螺旋线平面间的一些相互作用下形成 tNA 的三级结构即 L 折 叠，比如 TC 环( T 环) 和二氢尿嘧啶环 ( D 环) 1980 年 mtDNA 测序 发现，人类和牛科动物 mt tNASer( AGY)( Y = U 和 C) 没有完整的 D 环结 构( Fig 1D，III 型) 生化研究发现，mt tNASer( AGY)能氨酰化，而且在 体外具有翻译活性 进一步的晶体结构分析发现，其核心结构区的弹性比 0 型结构大 在核糖体上，反密码子环和 3CCA 末端之间存在约 78 度的类飞 镖结构; 由于 D 环的 G18 和 G19 以及 T 环的 U55 和 C56 均不保守，导 致 II 型 tNA 缺乏典型的 D 环和 T 环间的相互作用 ( Fig 1C，II 型) 对 tNAPhe 和 mt tNAAsp 的化学检测发现，D 环和 T 环间相互作用微 弱，但在 D 茎存在典型的三级作用，形成稳定的核心; 对 mt tNA 结构进 行深入研究发现。【6】 tNASer( UCN)同样具有不典型的三叶草结构( Fig 1B，I 型) 其结构 特征如下: 接受臂和 D 环间只有个腺苷酸; D 环缩短; 额外多 1 个环 化学 检测和电脑模拟结果显示，D 环或其它环核心区的多个缺失能通过增加反密码 子螺旋区的碱基对( 27a 43a) 来弥补，从而维持类 L 型的结构 mtDNA 处 于氧自由基的包围之中，缺乏组蛋白的保护，由于线粒体缺乏 DNA 损伤修复 系统，突变率是核 DNA 的 10 20 倍 选择压力在核基因中淘汰了许多突 变，而在线粒体中这种压力被松弛，由线粒体编码的蛋白质和 NA 突变后， 对个体的适应性比核编码的高【7】 由此造成哺乳动物 mtDNA 进化速率增快( 约为核 DNA 的 5 10 倍) ，可能是 mt tNA 序列和结构多态性的主要原 因之一 2.2 mt DNA 译码系统 遗传密码几乎是通用的，但是有极少数的例外哺乳动物线粒体 AUA、UGA、AG( = A 和 G) 分别翻译为 Met、Trp 和终止密码子( 这 与通常的译码不同，Table 1) 多数已鉴定的密码变化发生在线粒体中，而密 码的改变会对细胞蛋白质发生致命性的影响，由于线粒体有自己的 tNA，密 码的改变不影响细胞基因组【8】相反，在线粒体中，这种改变可以看做是一 种基因组的精简 最初的译码准则是密码子第 3 位的 U 只能被 A 和 G 识 别，然而 U34 的构象灵活多变，它与 4 种碱基都能配对( Crick 称其为变偶 性) 无修饰的 U 通过变偶配对降低了人类 mt tNA 的种类( Table 1) 仅 22 种 mt tNA 即可翻译 60 个有意义的密码子，这也是翻译有意义的密 码子最少的一组 tNA终止因子 mt F1a 识别终止密码子 UAA 和 UAG mNA CO1 和 ND6 的终止密码子分别是 AGA 和 AGG 因为两者都没有相 应的 tNA 和释放因子，长期以来 AG 一直作为它们的终止密码子，但这 个机制并不清楚 近年发现，哺乳动物 mt FIa 通过在 AG 密码子后移 一个读码框架来识别终止密码子。【9】 二、 线粒体疾病。 1、线粒体疾病的分类 线粒体疾病主要分为两大类:遗传性和获得性疾病,前者病因包括核 DNA 损害、 线粒体 DNA 损害和基因组间的通讯障碍,后者主要由毒素、药物和衰老引起。 目前的主要研究集中于线粒体 DNA 突变与线粒体疾病临床表型的相互关系上。 目前人们所认识的线粒体疾病主要是一些神经肌肉变性疾病,如 Leber s 遗传性 视神经病,线粒体脑肌病,帕金森氏病,阿尔茨海默病,母系遗传的糖尿病和耳聋等。 根据 mtDNA 突变的性质可以将其分为两种主要类型,即碱基替换突变和插入 缺失突变。碱基替换发生的位置不同,引起的突变效果也不同。发生在白质基因 上的碱基替换可以导致错义突变,进而影响蛋白质的功能。发生在 tRNA 和 rRNA 基因上的碱基替换可以影响 tRNA 和 rRNA 的结构,导致蛋白质合成障碍。10缺 失插入突变是指 mtDNA 在复制分离过程中发生了碱基序列的丢失或插入,其 中以缺失突变较为常见。大片段的缺失多发生在两个同向重复序列之间。最常 见的缺失突变是 4977bp 缺失,约 50%的 4977bp 缺失发生在 847013447 区 域两个 13bp 的同向重复序列(5-AC-CTCCCTCACCA)之间。还有一较为常见的 缺失是 7436bp 缺失,常发生在 863716073 区域两个 12bp 的同向重复序列。 【11】(5-CATCAA-CAACCG)之间。大片段的缺失往往涉及多个基因,最终导致线 粒体 OXPHOS 功能下降,产生的 ATP 减少,从而影响组织器官的功能。mtDNA 突 变导致的 OXPHOS 缺陷的严重性是由突变 mtDNA 的性质及其在细胞中所占的 比例决定的,而突变 mtDNA 的表型又与 OX-PHOS 缺陷的严重性及各个组织器官 的能量阈值有关。中枢神经系统及肌肉组织对 ATP 的需求量大,因此最易受累, 其它象心脏、肾脏、肝脏以及胰岛组织对 OXPHOS 缺陷也较敏感,故也常常出现 这些组织器官的变性疾病。【12】 2.线粒体脑肌病 ME 是一组由于线粒体功能缺陷造成的以神经肌肉系统病变为主的多系统疾病。 根据临床表现可分为伴有破碎红纤维的肌阵挛癫痫(MERRF),伴高乳酸血症中风 样发作的线粒全脑肌病(MELAS), Kearns-sayre 综合征(KSS),慢性进行性眼外肌 瘫痪(CPEO),神经源性肌软弱病、共济失调并发色素性视网膜炎(NAPP)等。(1) MERRF MERRF 是一种母系遗传病,主要表现为阵发性癫痫、骨骼肌不自主痉 挛伴破碎性红肌纤维病、全身性抽搐和小脑共济失调等。【13】通常在 1020 岁发病,晚期可出现精神异常。1988 年 Wallace 等7发现 MERRF 患者神经症状 严重程度和呼吸链中 NADH 脱氢酶、细胞色素 C 氧化酶活性降低程度均与 OXPHOS 缺陷相关,后来发现 MERRF 家系中存在一个 mtDNA 的 8344AG 的碱 基置换,该突变位于 mtDNA 的 tRNAlys 基因上,涉及到 tRNAlys 的 TUC 环,此环 参与 tRNA 与核糖体的连接,结果影响线粒体蛋白质的合成(主要是影响 OX- PHOS 复合体 I 和的合成),造成 OXPHOS 的功能下降,最终导致 MERRF 的多系 统病变。【13】8344 点突变产生了一个新的 CviJ I 酶切位点,可用于此病的诊断。 (2) MELAS MELAS 是一种不常见的母系遗传病,通常在 1020 岁发病,主要临 床表现为中风样发作、血乳酸中毒、近心端四肢乏力、间断性呕吐等。【15】 1990 年 Goto 等首次发现了 MELAS 患者中普遍存在有 mtDNA3243AG 突变, 目前认为 3243AG 突变是 MELAS 的主要致病因素。该突变使 tRNAleu 基因发 生突变,导致 16SrRNA 的合成减少,最终影响线粒体内蛋白质的合成。其它与之 有关的突变有 mtD-NA11084AG 突变和 3771 突变。Salvatore 等报道,在血液 中突变的比肌肉组织少,且在某些病例的血液中未发现有 mtDNA 突变,提示在 MELAS 突变检测血细胞是可行的,但不是绝对可靠的诊断依据。(3) KSS 和 CPEO 临床上以眼外肌麻痹伴有四肢乏力为主要症状者称为 CPEO。当伴有色 素性视网膜炎、听力丧失、心脏传导功能障。【16】 三、 相关线粒体疾病的治疗与干预策略 1、线粒体疾病是指线粒体基因组和核基因组突变导致氧化磷酸化 功能缺陷而引起的疾病。 异质性 mtDNA 突变致病的阈值水平相对较高，大多在 80%90%，所以只要 降低受累组织的突变负荷就可以达到治疗效果即通过将突变型 mtDNA 转变成 野生型 mtDNA。这样不仅使突变的 mtDNA 比率选择性地下降，而且野生型 mtDNA 的比率也可以升高。【17】线粒体靶向限制性内切酶改变突变异质性限 制性内切酶 (restriction enzyme, RE) 能在特异性限制位点选择性地剪切 DNA 双链。某些 mtDNA 突变会产生一个新的限制性酶切位点，线粒体靶向 RE 可以 识别这个位点，并对突变的 mtDNA 进行降解，使得剩余的野生型 mtDNA 比 率相对升高，从而降低细胞中突变 mtDNA 的比例，造成异质程度改变。线粒 体靶向 RE 最初用于异源线粒体的杂合细胞。【18】因大鼠 mtDNA 缺乏 PstI 位点，线粒体 PstI RE(mito-PstI) 的表达能够改变同时含有小鼠和大鼠融合细 胞的 mtDNA 异质性。含两种鼠类 mtDNA 单体型 (BALB 和 NZB) 的无症状 小鼠模型的体外和体内试验表明，用重组病毒载体定位于线粒体的 REs 表达 可以有效地改变 mtDNA 异质性。【19】这两种 mtDNA 单体型能够通过 RE ApaLI 区分，它能识别 BALB mtDNA 的一个位点，而不能识别 NZBmtDNA 中的位点。正因为只有 BALB mtDNA 突变体含有 ApaLI 特异性酶切位点，异 质小鼠局部注射编码线粒体靶向 ApaLI RE(mito- ApaLI) 的重组腺病毒后，肌 肉和脑部显示快速、定向且彻底的 mtDNA 异质性改变。mtDNA 异质性改变的 程度和效率依赖于未被剪切的 mtDNA 数量。【20】因为 ApaLI 只剪切 BALB mtDNA，余下的 NZB mtDNA 继续复制以维持正常 mtDNA 拷贝数，因此没有 观察到明显的 mtDNA 耗损。线粒体靶向 REs 可以作为异质性改变的策略， 但是主要的局限是合适的限制性位点的临床相关突变极少。 2、蛋白质转导/蛋白质转染 由于 mtDNA 编码的线粒体蛋白是疏水性的，这给外源蛋白的导入带来一定的 难度，蛋白质转导则是一种忽略蛋白质自身特性的新型导入方法，有细胞渗透 性质的蛋白质转导结构域的发现为克服上述问题提供了可能性。最常用的蛋白 质转导结构域是 TAT，它是 HIV 上较大的短阳性肽，能够穿过细胞膜。【21】 TAT 融合蛋白耦合细胞核定位信号(nuclear localization signal, NLS) 或线粒体 靶向序列(mitochondrial targeting sequence, MTS) 能够转导进入细胞并定位保 留在亚细胞相应区域。线粒体成功靶向导入的报道见于 TAT 介导的硫辛酰胺 脱氢(lipoamidedehydrogenase, LAD)，利用固有的 MTS 恢复了 LAD 缺陷患者 细胞内线粒体丙酮酸脱氢酶复合体的活性。【22】蛋白质转导的优势在于跨膜转 运不依赖 TIM 和 TOM 复合体，而劣势在于这是一种短暂的修复作用。 3、清除核苷 线粒体神经胃肠型脑肌病 (mitochondrial gastr-ointestinal encephalopathy, MNGIE) 属多系统疾病，患者常表现为严重的胃肠道功能障碍伴外周神经变性 及脑白质异常等，主要由胸腺磷酸化酶 (thymidinephosphorylase, TP) 缺陷导 致。【23】TP 活力降低可引起血液中脱氧胸苷和脱氧尿苷水平上升。目前，清 除血液中的核苷有三个方法 ：血液透析、异源干细胞移植和血小板灌注。 四、 展望 近年来科学水平飞速发展，各个科学领域都取得了重大突破，生命科学领域尤 为突出，故而在线粒体疾病研究方面可能会在近十年取得重大突破，对线粒体 结构及其内部酶的结构研究，将会对人类未来生命科学做出巨大贡献。 参考文献 【1】、张丽珊等、张丽珊等.国外医学遗传学分册国外医学遗传学分册,1995;18(1):3 【2】、戚豫等、戚豫等.中华医学遗传学杂志中华医学遗传学杂志,1995;12(2):89 【3】、李方园、李方园,等等.中华医学遗传学杂志中华医学遗传学杂志,1994;11(4):193 【4】、张庆等、张庆等.中华医学遗传学杂志中华医学遗传学杂志,1997;14(2):88 【5】、张庆等、张庆等.中山医科大学学报中山医科大学学报,1997;18 增刊增刊:57 【6】、卢义钦等、卢义钦等.国外医学分子生物学分册国外医学分子生物学分册,1996;18(3):135 【7】、周小龙，王恩多、周小龙，王恩多 与人类疾病相关的几种线粒体氨基与人类疾病相关的几种线粒体氨基- tNA 合成酶合成酶 生物化学与生物物理进展。生物化学与生物物理进展。 【8】、张均田、张均田. 脑缺血、葡萄糖脑缺血、葡萄糖/能量代谢障碍与神经退行性能量代谢障碍与神经退行性 疾病疾病.中国药理通讯中国药理通讯, 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