细胞毒性t细胞作用的分子机制04

第四章第四章 细胞毒性细胞毒性 T 细胞作用的分子机制细胞作用的分子机制 免疫系统针对病原所产生的免疫应答分为两大类：以抗体为主体介导的中和细胞外病 原体的体液免疫反应和以细胞毒性 T 细胞（CTL）为主体介导的特异杀伤被感染靶细胞的 细胞免疫反应。其中细胞免疫反应对于彻底地杀灭病原体、清除被感染的“改变”了的自 身细胞显得尤为重要。细胞免疫反应包括 NK 细胞等介导的非特异性靶细胞杀伤和 CTL 为 主、Th 细胞为辅所介导的特异性靶细胞杀伤。CTL 对于被感染细胞的 MHC I 类分子限制 特异性的杀伤是细胞免疫应答的重要内容，其研究对于了解免疫识别、免疫杀伤以及新型 疫苗的分子设计都有重要意义。 第一节第一节 CTL 作用概述作用概述 CTL 即杀伤性 T 细胞，是一类具有 CD8+表面标志、受 MHC I 类分子限制性杀伤功能 的 T 细胞。CTL 的重要功能是可以特异性地杀伤靶细胞。CTL 介导的靶细胞杀伤的特点是： 杀伤受 TCR 以及 MHC I 类分子的严格限制。CTL 对靶细胞的杀伤还具有特异性、程序性 和快速性的特点。另外，IL-2 和其它一些细胞因子在 CTL 前体的体外培养和效应 CTL 的 分化诱导中也起着重要作用。 一、一、CTL 的主要生物学功能的主要生物学功能 CTL 对感染了病原的靶细胞杀伤构成了细胞免疫的重要部分。CTL 在识别“改变” 了的自身细胞，如病毒感染细胞、恶性细胞和移植反应中的移植细胞等起着非常重要的作 用。由于人体所有的有核细胞都表达 I 类 MHC 分子，因此，CTL 原则上可以识别和清除 几乎所有改变了的自身细胞。 二、二、CTL 作用的作用的 MHC 限制性限制性 CTL 的杀伤作用受 MHC 严格限制。CTL 在杀伤抗原特异性靶细胞过程中，不识别可 溶性抗原或者与非自身 MHC I 类分子结合的抗原，而只能识别与自身 MHC I 类分子相联 系的特异性抗原多肽。 三、三、CTL 的组成的组成 CTL 的命名是根据体外与一定比例的特异性靶细胞孵育后杀伤一定百分率的靶细胞这 一功能来确定的。因此，CTL 不是一种特定的细胞，而是一个具有特异性杀伤活性的 T 细 胞群体。在组成上，它包括 CD8+T 细胞和 CD4+T 细胞。 1、CD8+ T 细胞 主要有TCR 型 CD8+T 细胞和TCR 型 CD8+T 细胞。前者以 TCR 识别靶细胞表面上的 MHC I 类分子-肽复合物（图 1 ） ；后者则以TCR 识别靶细 胞表面的 抗原肽抗原肽 CD4+ TCRTCR CD8+ HLA-I HLA-II 图 1 TCR-抗原肽-HLA 三分子复合物 MHC I 类分子-肽复合物。尽管TCR 型 T 细胞仅占 CTL 群体中的极小部分，但在对一些 特殊抗原的免疫反应中，它们起着非常重要的作用。 2、CD4+T 细胞 CD4+T 细胞通常被认为是在抗原免疫过程中通过分泌细胞因子及表 达表面分子介导细胞间相互作用，来调节和增进体液免疫和细胞免疫反应，主要起辅助作 用。但在某些情况下，CD4+T 细胞也具有杀伤功能，且主要依赖 Fas-FasL 机制。实验证明 当抗原由 II 类 MHC 分子而不是由 I 类 MHC 分子呈递时，CD4+T 细胞可以取代 CD8+T 细 胞而发生反应，成为杀伤性的 CTL。 四、四、CTL 作用的主要过程作用的主要过程 CTL 介导的靶细胞杀伤反应可分为 3 个阶段：识别启动、增殖分化及效应阶段。 1、识别启动阶段 在这一阶段，CTLp（CTL 前体）通过表面的 TCR 特异性地识别并结合靶细胞表面呈 递的 I 类 MHC 分子-抗原多肽复合物，和其它若干对表面分子的配体（图 2） 。 图 2 参与 T 细胞活化的膜表面分子 2、增殖分化阶段 在此阶段，Th 细胞发生大量增殖并分泌 IL-2 等细胞因子；CTL 则在特异性增殖的同 时，自前体细胞分化成为效应 CTL。 （1）Th 细胞的增殖对 CTLp 分化的辅助作用 当 CTLp 识别了呈递于靶细胞表面与 I 类 MHC 分子相结合的特异性抗原多肽后，特征性地表达 IL-2R（受体） 。由于此时 Th 细 胞也受到特异性抗原的刺激，产生大量的 IL-2。这些 IL-2 与激活的 CTLp 表面的 IL-2R 结 合，使得 CTLp 发生特异性的增殖，逐步分化成为成熟的效应 CTL。 （2）巨噬细胞对 CTLp 分化的辅助作用 研究证明巨噬细胞的作用是用以激活 II 类 MHC 限制性的 Th 细胞。 （3）细胞因子对 CTL 的产生调节 多种细胞因子，包括 IL-2、IL-4、IL-7、IL- 10、IL-12 和 IL-15，其中 IL-2 诱导 CTL 杀伤活性的能力较强。这些细胞因子通过诱导相 关基因的表达，使 CTLp 朝着成熟方向分化，并使抗原特异性 CTL 克隆的生长和增殖加快。 3、效应阶段 CD4 MHC- II TCR/CD 3ICAM-1 B7-1 B7-2 LFA-1 LFA-1 ICAM-3 LFA-3 B7-1 CD28 CD28 LFA-1 ICAM-3 CD2 T T细胞细胞 APC CTLA-4 在效应阶段，已分化成熟的效应 CTL 发挥其杀伤功能，特异性裂解靶细胞。作用的 过程可分为 4 个阶段：识别与结合、细胞器重排与颗粒外吐、CTL 解离、靶细胞解体（图 3 ） 。 （1）识别与结合 CTL 表面的 TCR 识别并结合靶细胞表面的 I 类 MHC-多肽复合体， 同时还需其它若干对表面分子参与，才能加强和稳定 CTL 与靶细胞的结合。其中，CTL 上 的 CD11a/CD18 （LFA-1）与靶细胞上的 ICAM-1 或 ICAM-2 可能是最重要的一对结合分 子。 CTL 再循环 颗粒 CTL CD8 TCR 偶合物 CTL 细胞 CTL 颗粒 MHC I-肽 形成 器重排 外吐 膜损伤 靶细胞 图 3 CTL 介导的靶细胞杀伤过程 （2）细胞器重排与颗粒外吐 CTL 上的 TCR 是与细胞内一些细胞骨架成分如小管和 肌动蛋白偶联的。当 TCR 与靶细胞上的 MHC I-多肽复合体交联后，将通过这些细胞骨架 成分启动细胞器的重排。高电子密度的颗粒明显地向靶细胞方向移动，并在结合部位直接 外吐颗粒内含物质，对靶细胞膜进行攻击。这一胞质颗粒的外吐是由 Ca2+流入 CTL 所诱发 的。 （3）CTL 解离 CTL 向靶细胞释放颗粒内含物后，即完成其杀伤过程，开始与靶细 胞解离。离开靶细胞后，又可重复以上过程，重新结合靶细胞，重复杀伤。因此 CTL 可以 杀伤多个靶细胞，即 CTL 可循环利用。 （4）靶细胞解体 CTL 离开靶细胞后，靶细胞开始出现核膜与细胞膜的破裂，直至 细胞裂解死亡。 第二节 CTL 分子机制及应用前景分子机制及应用前景 一、一、CTL 作用的分子模式作用的分子模式 CTL 杀伤靶细胞的分子机制包括胞质颗粒依赖机制和 FasL-Fas 介导的凋亡机制（图 4） 。 1、胞质颗粒依赖机制 CTL 可以通过外吐胞质颗粒，释放颗粒内含物，导致靶细胞的损伤。CTL 胞内含许多颗粒， 直径 0.51m，主要有两种成分：颗粒核心核多囊泡结构。颗粒核心中包含穿孔素、颗粒 酶和粘蛋白，而多囊泡结构则包含溶酶体酶和溶酶体的一些膜标志。穿孔素是胞质颗粒中 参与靶细胞损伤过程的最主要蛋白，穿孔素似乎唯一地表达于 CTL 颗粒中。它可在靶细胞 膜上聚合，形成穿膜孔道，以穿孔方式裂解靶细胞。 （1）穿孔素的穿孔机制 穿孔素是一个含 555 个氨基酸的糖蛋白，分为两个重要的 功能区：补体同源区和 C2 区。穿孔素以单体存在，插入靶细胞膜中，发生聚合，产生多 种不同聚合数目的多聚体。 CTL 通过可咯外吐方式释放出穿孔素，进入细胞间隙。穿孔素在 Ca+存在下，引起构 象变化，暴露其疏水基团，附着并插入脂质双层膜中，在靶细胞膜表面形成多个孔洞，最 终引起靶细胞解体。 靶细胞 CTL 穿孔素 颗粒酶 颗粒外吐 FasL Fas FasL FasL 蛋白 凋亡信号 图 4 CTL 杀伤的胞质颗粒酶依赖和 Fas/FasL 凋亡机制 （2）胞质颗粒内其它酶或分子依赖的非穿孔素机制 A 丝氨酸脂酶/颗粒酶；B 粘蛋 白； TNF。 2、非胞质颗粒依赖机制FasL/Fas 机制 CTL 对靶细胞的杀伤主要引起靶细胞的膜结构破裂以及核 DNA 的快速降解，但胞质 颗粒依赖机制只能引起靶细胞的膜结构破裂，而不能导致靶细胞核 DNA 的降解，目前认 为 Fasl/Fas 介导的细胞凋亡是 CTL 杀伤靶细胞的非胞质颗粒依赖机制。 Fas/Apo-1 即 CD95 分子，编码分子量 45103单位？的跨膜蛋白，是 TNF 受体相关蛋 白（TNFR）的一种。Fas 蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其中胞内区含一个与细胞 凋亡相关的死亡区域。Fas 主要以膜受体形式存在，广泛表达于外周活化 T、B 细胞，NK 细胞，单核细胞，成纤维细胞等。FasL 是分子量为 30103单位？的 TNF 相关 II 型膜蛋白， 也由细胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区与 TNF 家族成员高度同源。FasL 除了在 淋巴细胞表达外，还在其他一些细胞表达，包括巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、神经 元细胞和若干肿瘤细胞。因靶细胞上的 Fas 与 CTL 等具有杀伤功能的细胞上的 FasL 结合 是诱导靶细胞产生凋亡的主要途径之一，因此 Fas 可称死亡分子，FasL 则称死亡因子。 FasL-Fas 作用的分子机制 FasL-Fas 机制介导的杀伤过程可分为两个时期：激活启动 期和 FasL-Fas 结合期。FasL-Fas 机制的启动仍然必需 CTL 上的 TCR 对靶细胞 MHC I-肽复 合物的识别，同样需要 CTL 与靶细胞发生 Mg+依赖的结合和粘连。激活期依赖于细胞外 Ca+/Mg+环境的存在以及细胞内 RNA 合成与蛋白合成所需的酶与基质。TCR 对靶细胞 MHC I-肽复合体的识别与结合同时启动了 CTL 染色体 DNA 上 FasL 基因以及靶细胞染色 体 DNA 上 Fas 基因的转录和翻译，随后，FasL 表达在 CTL 细胞膜上，Fas 表达于靶细胞 膜上。在一些粘附分子的辅助下，二者有效地发生结合。 Fas 在配体的诱导下，形成三聚体，三聚体的形成导致一种级联反应衔接子Fas 相关的含死亡区域的蛋白（FADD/MORT1）的募集。而 FADD 含一个蛋白-蛋白作用区域， 又称死亡效应区域，可使 FADD 与其他含死亡效应区域的蛋白（如 FLICE/MACHI/Mch5 caspase-8/胱冬肽酶 8，N 端含 2 个独立的死亡效应区域）形成二聚体。Fas 三聚体对 FADD 的募集又导致对 caspase-8 前体的募集，这样便形成了 Fas 信号传导复合物。caspase-8 前体 发生自催化剪切，释放有活性的蛋白酶亚基。一旦被激活，caspase-8 可连续激活其他的下 游 caspase，并可降解其在胞内的底物。经过 caspase 的一系列反应，细胞最终走向细胞凋 亡（图 5 ） 。 、细胞因子介导途径 （）细胞因子介导途径的作用机制 在人类的病毒感染期，至少有两种以上的机制 联合才能实现病毒的完全清除。首先，病毒特异性 CTL 识别并杀伤一小部分被感染的靶细 胞；其次，病毒特异性 CTL 可分泌炎性细胞因子直接或间接（通过激活巨噬细胞）地通过 抑制病毒在胞内复制来治疗大部分的被感染的细胞。 凋亡信号 FasL Fas CTL 靶细胞 活化 caspase-8 FADD 原 caspase-8 图 5 FasL-Fas 通路导致细胞凋亡机制 （）细胞因子介导的双重作用 细胞因子作用机制还不完全明确，但它在产生抗病 毒效应的同时，也可能使病毒降低其复制水平以逃避免疫系统的识别。已知不完全/不足量 的病毒激活或者免疫系统的功能减退将会导致若干感染细胞内病毒抗原表达的下调，其微 小的量正好可使这些感染细胞逃避免疫细胞如 CTL 的识别，从而引起病毒的持续性感染和 慢性肝炎的发生。因此，细胞因子介导途径也可能具有双重性。一方面，机体通过 CTL 来 源的细胞因子抑制病毒表达和复制，清除病毒，有效发挥了机体的抗病毒功能；另一方面， 病毒可能利用这一机制下调基因的表达和病毒颗粒的装配，逃避 CTL 的识别，以此作为持 续感染的生存策略。 二、基因免疫诱导的二、基因免疫诱导的 CTL 反应及其作用反应及其作用 DNA 免疫是一种给予抗原（免疫）的新手段，它通过将目的基因克隆于真核表达载 体后直接注入机体，表达相应抗原，诱生免疫反应。1993 年，Ulmer 等将流感病毒 NP 表 达质粒注射小鼠骨骼肌，不仅检测到特异性 IgG 抗体，而且免疫小鼠的脾细胞在体外可特 异性杀伤 NP 致敏的靶细胞，证实 DNA 免疫同时可诱生特异性的 CD8+CTL 应答。与常规 蛋白质疫苗免疫相比，DNA 免疫具有易制备、操作简便，并可诱导体液免疫和细胞免疫应 答的优势，因此已成为抗病毒感染新型疫苗研制的热点。 病毒感染的清除主要依赖于特异性体液免疫和细胞免疫应答。体液免疫通过特异性抗 体中和细胞外游离的病毒，而细胞免疫应答则主要通过特异性 CTL 识别、杀伤、破坏病毒 感染的细胞，清除胞内感染的病毒。以不同病毒抗原编码基因为目的基因构建真核表达重 组体进行 DNA 免疫，诱生了针对不同病毒的特异性 CTL 应答，并证实这些特异性 CTL 应 答在清除病毒感染中起重要作用。 1、DNA 免疫诱导的病毒特异性 CTL 反应 将病毒特异性抗原编码基因置于真核启动子（通常称为病毒启动子）调控下，构建真 核表达载体，以此裸露质粒 DNA 直接注入机体，诱生了针对不同病毒的特异性 CTL 应答。 2、DNA 诱导特异性 CTL 反应的可能机制 DNA 免疫与传统蛋白免疫相比，具有持续表达抗原和诱生全面的免疫反应如中和抗 体、CTL 和 Th1 等优点。可能是 DNA 导入部位抗原的有效呈递。将 DNA 直接导入体内， 多种专职 APC 细胞如 LG 细胞、树突细胞、巨噬细胞和 B 细胞，可直接被 DNA 转染，而 后表达抗原并行使 APC 功能。DNA 注射部位的（肌肉）细胞不起呈递抗原的作用，真正 将抗原呈递给免疫系统的是骨髓来源的专职 APC。这一机制也可以解释 DNA 免疫为何能 同时诱导 CTL 和 Th 细胞应答。少量的专职 APC 可直接在注射部位被 DNA 转染产生内源 性蛋白抗原表达，而后借助蛋白酶体和 TAP 复合物将蛋白装载于 MHC I 类分子上，完成 内源性抗原呈递途径，产生 CTL。大部分的蛋白抗原是有肌肉细胞表达的，以外源抗原方 式转给专职 APC 细胞，诱导 Th 反应。此外，外源性蛋白也可激活 MHC I 类限制性 CTL。 3、DNA 免疫诱生的 CTL 应答在清除病毒感染中的作用 CTL 应答在病毒感染尤其是持续性病毒感染的清除过程中起着重要作用。通过构建不 同 CTL 抗原表位的质粒进行 DNA 免疫，检测其诱导 CTL 的特性，可迅速、准确地确立天 然病毒蛋白中的特异性 CTL 抗原表位，以便于新型疫苗的分子构建。同时以此可进一步阐 明病毒诱生的特异性免疫应答的优点及病毒感染的致病机制和防治策略。 三、增强三、增强 CTL 应答的新策略应答的新策略 1、增强 MHC类分子对内源性多肽的呈递 在 CTL 应答的诱生中，内源性抗原必须经 MHC I 类分子有效呈递，才可被 CTL 特异 性识别。首先，抗原在细胞内经多功能蛋白酶体（LMP）降解为短肽，随后进入内质网中， 与在内质网中新合成的 MHC I 类分子有效结合，经高尔基体最后呈递于细胞外膜。因此如 何将抗原多肽转运至内质网，对于有效呈递至关重要。目前已知有两种不同的分子机制： 伴随蛋白、TAP 及内质网转运或插入信号序列参与抗原多肽向内质网转运过程。 2、增强 DNA 免疫中外源基因导入细胞及细胞内的稳定存在和持续表达 DNA 免疫所选用的表达载体一般是真核表达载体，而免疫对象又是真核生物细胞。 通常，它们不具备在宿主细胞内自主复制的能力。因此，当把 DNA 直接注入机体之后， 编码基因所在的质粒载体只能在宿主细胞内一过性表达，之后，随细胞的分裂而逐渐丢失。 所以，进入机体细胞的 DNA 所表达的蛋白量应当足以诱生特异性免疫应答。增加外源基 因导入细胞的效率，可提高外源基因在宿主细胞中的量，从而提高外源基因的表达水平， 是增强 DNA 免疫效果的手段之一。 已知 EBV 在体内可感染人 B 细胞，体外转化 B 细胞使之永生化。EBV 感染 B 细胞后， 呈隐性状态，DNA 以闭环形式游离于染色体外，可