毕业论文 海洋来源活性化合物407靶向JAK stat3的信号通路研究.pdf

分类号分类号密级密级 udc 本本 科科 毕毕 业业 论论 文文 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 学生姓名学生姓名 赵娇赵娇 学号学号 180112011073 指导教师指导教师 戚欣戚欣老师老师 院、系、中心院、系、中心 医药学院医药学院 专业年级专业年级 药学药学 2011 级级 论文答辩日期论文答辩日期 2015 年年 6 月月 日日 中中 国国 海海 洋洋 大大 学学 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 完成日期： 指导教师签字： 答辩小组成员签字： i 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 摘 要 目的目的：研究海洋来源活性化合物 407 对 jak/stat3 信号通路上游信号分子 和下游靶基因蛋白表达的影响。 方法方法： 407 分别作用于 hct-116 细胞 1h、 24h， 裂解细胞，western blot 检测对 stat3 上游信号通路和下游靶基因表达产物的 影响。 结果结果： （1） 407 对 stat3 的自身表达无明显影响， 但可明显抑制 p-stat3 （tyr705）的表达水平，随着剂量增加抑制作用也增强。对上游的 jak 的活化 没有明显影响。 （2）407 作用 hct-116 细胞 24h，407 使 stat3 信号通路下游 靶基因表达产物 mcl-1、 survivin、 vegf、 mmp-9 表达水平成剂量依赖性降低。 结论结论：海洋来源活性化合物 407 对 stat3 信号通路上游 jak 分子活化无明显 影响，可下调下游靶基因 mcl-1、survivin、vegf、mmp-9 的表达。 关键词：407、stat3 信号通路、肿瘤 ii studies of marine derived compounds 407 targeted jak/stat3 signal pathway abstract purpose: research on the molecular mechanism of the anti-tumor effect of 407, and determine the target. methods: 1. test the effect of 407 on stat3 signaling pathway and the proteins of downstream target gene expression by western blot after 407 act on hct-116 1h or 24h. results: 1. 407 on the expression of stat3 had no significant effect, but can significantly inhibit the expression of p-stat3 (tyr705), as the dose increases, the inhibitory effect is enhanced. 2. 0.125, 0.25, 0.5 and 1 m l-1 407 act on hct-116 last 24h, the results show that the content of mcl-1, survivin, vegf, mmp-9 all reduce. conclusion: bioactive compounds from marine sources 407 on stat3 signaling pathway upstream jak molecular activation had no significant effect, but it can reduce the expression of downstream target gene expression of mcl-1 gene, survivin, vegf and mmp-9. key wordskey words: 407, stat3 signal pathway, cancer iii 目目 录录 1 前言 1 1.1 stat 信号通路 1 1.1.1 stat3 简介 . 1 1.1.2 stat3 的活化 . 1 1.2 肿瘤与 stat3 信号通路 2 1.2.1 肿瘤 2 1.2.2 结肠癌 3 1.2.3 stat3 信号通路与肿瘤 . 4 1.2.4 stat3 抑制剂研究现状 . 5 1.3 海洋来源活性化合物 407 . 7 1.4 本实验的研究目的 . 7 2 实验材料 8 2.1 细胞株 . 8 2.2 实验试剂 . 8 2.3 实验仪器及耗材 . 9 2.4 缓冲液及其他溶液配制: 9 3 实验方法 . 12 3.1 细胞培养 12 3.2 细胞传代 12 3.3 细胞复苏 12 3.4 细胞冻存 13 3.5 407 对 stat3 相关信号通路的影响 13 3.5.1 蛋白样品制备 . 13 3.5.2 western blotting 检测 13 3.6 407 对 stat3 靶基因表达产物含量的影响 14 4 实验结果与讨论 . 14 5 结论 . 16 参考文献 17 致谢 19 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 1 1 前言 1.1 stat 信号通路 1.1.1 stat3 简介 信号转导和转录激活因子家族，简称为 stat 家族，是一类胞浆蛋白，同 时具有信号转导和转录活化功能，能够与不同的细胞因子受体结合，并将胞外 信号传递到细胞核内完成信号转导过程，并引发细胞核内相应靶基因的转录与 表达1。stat 家族重要成员之一的 stat3 分子，是慢性炎症促肿瘤发生中不 可或缺、在肿瘤相关炎症形成过程中发挥着至关重要作用的关键分子，它可影 响调控炎症因子的胞外信号，从而改变免疫细胞、肿瘤细胞等细胞的生物学行 为。 stat3 结构包括七个部分：1、sh2 区，位于第 600700 位氨基酸之间， 促使 stat3 与已活化的受体形成复合物，介导 jak/stat3 间的相互作用,使 stat3 形成二聚体并进入细胞核， 识别并结合 dna， 开启特定靶基因进行转录； 2、sh3 区，位于第 500600 位氨基酸之间，保守性较差，但目前对其功能仍 不清楚；3、羧基端第 705 位的酪氨酸磷酸化位点(y705)， stat3 活化是由该 位点的磷酸化引起的； 4、 dna 结合区， 其最佳结合序列为 ttcc(g/c)ggaa， 位于高度保守的第 400500 位氨基酸中；5、保守性较差的羧基端，含有转录 激活区(tad)，与转录激活有关；6、第 727 位的丝氨酸磷酸化位点(s727)，可 能被有丝分裂原激活的蛋白激酶(mapk)磷酸化，从而激活 stat3，使 stat 途 径和 ras 途径发生联系；7、保守的氨基酸序列，是 stat3 和其他转录因子之 间的作用、stat3 二聚体的形成以及细胞因子受体间的结合等功能的必需部分 2。 1.1.2 stat3 的活化 stat3 在信号传递过程有十分重要的作用，能将细胞外的信号传递到细胞 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 2 核并进行转录表达。stat3 信号分子可受多种因素作用激活，包括细胞因子、 生长因子和致癌因子等，这些因子分别与其对应的受体发生特异性结合后，经 不同方式引起 stat3 的磷酸化以达到活化目的，从而完成进一步的信号转导过 程。 stat3 具有三种方式进行活化：一是 jak/stat3 途径，也是 stat3 信号 转导与转录激活的经典途径：这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受 体，这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激 酶 jak 的结合位点，如：ifn、il、lif 等，受体与配体结合后，通过与之结 合的 jak 的活化，来磷酸化 stat3 分子上的酪氨酸残基达到活化目的，实现 信号从胞外到胞内的传递3。二是受体本身具有酪氨酸激酶活性，这些受体包 括 egfr 和 fgfr、her2、pdgfr、hgfr、vegfr 等，不依赖 jak 激酶， 受体与配体结合后， 可以直接磷酸化 stats。 三是通过 g 蛋白途径磷酸化激活， 如：血管紧张素。 两个磷酸化的 stat3 分子（p-stat3） ，与磷酸化的酪氨酸相互作用，以 sh2 结构域为媒介， 形成二聚体， 离开受体后的二聚体， 通过核孔进入细胞核， 识别核内靶基因并与之结合，激活他们的转录和表达4 。stat3 的重要靶基因 产物包括： 调控细胞核内与细胞周期进程及程序性细胞死亡的相关蛋白 （bcl-2、 mcl-1 等） 、与增殖相关的蛋白（survivin 等） 、细胞侵袭相关蛋白（mmp-9 等） 与血管生成有关的蛋白（vegf 等） 。因此，stat3 在维持并调控细胞生长、胚 胎发育、程序性细胞死亡、免疫等正常机体生物学行为的过程中不可或缺，其 异常活化与多种疾病的发生、发展密切相关5。 1.2 肿瘤与 stat3 信号通路 1.2.1 肿瘤 恶性肿瘤，又称癌症，是目前致死率最高的疾病，因此也被成为“头号杀 手” ，人们更是谈“癌”色变。肿瘤的发生和发展是一个渐进过程，由多种因素 影响，物理、化学、环境污染等致癌因素，遗传，人体内分泌失调甚至创伤均 可引发癌变6。肿瘤发生也是一个复杂的过程，它由细胞的增殖分化、凋亡抑 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 3 制、 、扩散转移能力、接触介导的生长抑制以及血管形成等各个环节、多个因素 调节，才可达到平衡状态7。 20 世纪以来，治疗肿瘤的常规方法主要有外科手术，放疗和化疗。但是这 些治疗方法的治疗效果并不理想，仍存在治愈率低，复发率和患者死亡率高等 缺陷，不能有效的治愈肿瘤。近年来，随着科学技术的不断发展，对肿瘤治疗 的研究也成为了医学研究热点，对治肿瘤药物研究及研发也越来越多。化学治 疗，即用化学合成药物治疗肿瘤，其原理为药物通过诱导肿瘤细胞凋亡或死亡 而达到治疗效果， 临床一般会结合放疗同时使用， 作为辅助方式增强治疗效果。 目前临床使用的化疗药物基本上都有其特定的作用靶点，药物作用在这些与控 制细胞增殖的酶相关的靶点上，进而阻碍肿瘤细胞的增殖或诱导肿瘤细胞发生 凋亡，从而达到治疗癌症的目的8。这些药物一般都有很强的细胞毒作用，除 能够阻碍肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡外，也会对周边或机体正常细胞造 成很大伤害，尤其是毛囊和骨髓细胞这些生长快的细胞，还会使免疫系统受到 严重损伤，并伴随脱发及呕吐等不适反应，同时还可能有其他不良反应威胁生 命。所以，寻求更佳的肿瘤治疗方法及药物是目前研究的重点，使药物能够靶 向作用在肿瘤细胞上，而对正常细胞的生理状态无影响或影响极小。 为解决上述化学治疗药物的问题，目前新型抗肿瘤药物研究的重点和热点 是开发分子靶向治疗药物，其主要研究内容是根据细胞内已明确的致癌位点的 蛋白或基因设计相应药物，药物进入机体后与致癌位点的蛋白或基因发生特异 性结合并作用，致使肿瘤细胞凋亡或死亡，但在这个过程中不影响肿瘤细胞周 围正常细胞的生理状态9。 1.2.2 结肠癌 随着工业的快速发展，经济水平的不断提高，人们生活节奏的加快且生活 方式发生较大改变，癌症的发病率也逐年上升，其中结肠癌作为一种常见的消 化道恶性肿瘤，受生活方式影响更大，其发病率更是在许多地区逐年升高10。 根据最近统计结果显示，结肠癌的年死亡率为 2030/10 万，在发达国家的恶 性肿瘤中其发病率位居第 2 位 11。 目前，结肠癌的主要治疗方式仍以外科手术为主，虽然结合其他治疗手段 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 4 使治疗效果得到一定改善，但 5 年生存率仍在 50左右，仍不能有效的治愈结 肠癌12。 现在临床上药物治疗结肠癌的一种常规疗法是以 5-氟脲嘧啶（5-fu） 为基础的化疗方案，但多重耐药使得 crc 对于各种化疗方案的敏感性低于 40%13 。临床治疗失败及患者死亡的主要原因是肿瘤产生耐药性及复发后肿瘤 发生转移，药物的副作用使药物的临床应用在一定程度上受限14。因此，肿瘤 防治面临的迫切任务及当今临床与基础研究的重点是进一步探讨结肠癌的发病 机制，寻找低毒有效的抗肿瘤药物，目前的研究方向中调控肿瘤细胞增殖与凋 亡的相关信号通路是重要的一部分。 结肠癌的发生发展受饮食、环境、遗传等因素影响，多个基因协同作用。 结肠癌预防及治疗的研究已引起人们的广泛关注，通过检测相关基因，对预测 结肠癌的发生、 发展、 治疗及预后判断均有一定的指导意义 15。 已有研究发现， vegf、 survivin 及其他 stat3 信号通路靶基因均与结肠癌的发生发展有关。 因 此可见，研究药物对 stat3 信号通路及下游靶基因表达的影响对开发治疗结肠 癌药物有很好的指引作用，stat3 信号通路可作为治疗结肠癌的一个可靠靶点 进行研究。 1.2.3 stat3 信号通路与肿瘤 临床研究发现， stat3 在多种恶性肿瘤细胞中均发生了高表达， 尤其肝癌、 结肠癌、乳腺癌、胃癌等多种常见肿瘤中，并呈现一定负相关性，即其活化程 度越高，肿瘤患者的预后就越差16。stat3 可以上调肿瘤细胞的增殖及抑制其 凋亡，并可促进肿瘤细胞的侵袭及转移。 stat3 作为细胞内一条信号通路中的重要分子不仅对维持正常细胞功能具 有作用，对肿瘤细胞的发生发展也有十分重要的作用，也因此受到相关领域科 学家的关注，目前 stat3 及其信号通路已经成为抗肿瘤药物研发的一个重要靶 点。肿瘤的发生发展主要与 stat3 信号通路下游靶基因的转录表达蛋白有关： 在 stat3 信号通路下游靶基因中， 关于抗凋亡和细胞增殖相关的蛋白在 stat3 信号分子被相关因子活化后表达量增多， 能够促进细胞增殖， 并抑制细胞凋亡， 引发细胞癌变，引起肿瘤的发生发展；肿瘤细胞形成后，由于其较正常细胞体 积大且增殖速度快，因此其所需营养物质增多，这时 vegf 等生长因子表达量 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 5 增多，stat3 的活化促 进新生血管的形成， 为肿 瘤细胞生长提供支持及 营养成分；stat3 活化 后， 与细胞迁徙和侵袭相 关的 stat3 信号通路下 游 靶 基 因 表 达 产 物 mmps 等蛋白增加， 促进 肿瘤细胞发展； 除此之外， stat3 还与肿瘤微环境 中的多种免疫/炎症细胞 有关（如图 1）17 18。 stat3 的活化在正 常细胞中所需时间极为 短暂，但在肿瘤细胞内， stat3 的酪氨酸残基由于生长因子及细胞因子的失调，将会持续磷酸化，导致 处于激活状态的 stat3 处于异常高的状态，致使正常的细胞凋亡-增殖失衡， 诱导肿瘤新生血管的增殖19。持续、异常激活的 stat3 信号通路可以以包括 促进细胞增殖、抑制肿瘤细胞免疫反应、诱导肿瘤血管新生等机制促进肿瘤的 发生发展，与肿瘤细胞的存活、增殖、免疫抑制、肿瘤炎症反应、肿瘤细胞迁 移、侵袭密切相关，在肿瘤的发生发展中扮演了举足轻重的角色。 1.2.4 stat3 抑制剂研究现状 综上所述，stat3 可作为肿瘤分子靶向治疗的重要靶点进行研究，抑制 stat3 的过度活化可以有效控制肿瘤的发生发展， 因此 stat3 抑制剂成为现在 的研究热点。目前研究较多的 stat3 抑制剂可分为肽类、非肽类以及由计算机 模拟筛选出的小分子类。 天然产物中提取纯化获得的抑制剂作用机制比较复杂， 且这些抑制剂中大部分属于非肽类抑制剂，该类抑制剂的主要作用机制有：1、 直接下调 stat3 蛋白水平；2、作用于信号通路中与 stat3 分子活化有关的分 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 6 子，阻止 stat3 分子的磷酸化、形成二聚体及二聚体转移入细胞核；3、抑制 stat3 二聚体与核内 dna 中的靶基因结合；4、调控 stat3 信号通路下游的靶 基因表达20。但目前肿瘤治疗药物中 stat3 特异性抑制剂仍较少，研究进展 较慢，且大多处于体外水平基础研究阶段，体内研究及临床试验报道较少。除 此之外，stat3 抑制剂的最佳分子靶点仍未确定，需进行进一步研究。所以， 在未来的研究中，为寻找能够在临床上应用于肿瘤治疗的 stat3 抑制剂药物， 进行 stat3 抑制剂的体内研究尤为重要， 以期早日发现有效的天然产物 stat3 抑制剂。 目前虽有很多 stat3 抑制剂处在研究阶段，也取得了一定进展，其中以小 分子抑制剂研究最广,但是小分子抑制剂作用靶点单一、价格昂贵，与之相比， 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 7 天然药物中 stat3 抑制剂则因价格低廉，具有多环节和多靶点效应等特点受到 越来越多的关注与研究，而且已经从其中筛选出多种 stat3 抑制剂在骨髓瘤、 肝癌及恶性神经胶质瘤等方面有突出作用，目前对于天然 stat3 抑制剂主要集 中在黄酮类、生物碱类和萜类等天然药物单体的研究上,现分述如表 121： 1.3 海洋来源活性化合物 407 海洋来源活性化合物 407 是一种真菌毒素，由中国海洋大学医药学院天然 产物化学二室纯化制得， 中文名称单端胞菌毒素(trichothecene) （结构式如图 2） 。 前期实验已经发现该化合物体外对多种肿瘤细胞株有生长抑制作用，其中对 hct116 结肠癌细胞抑制作用最强。pi 染色发现，407 可引起 hct-116 细胞核 断裂诱导细胞凋亡。流式细胞仪分析结果表明，407 对 hct116 细胞有周期阻 滞，能够将细胞阻滞在 g2/m 期。进一步研究发现，407 能够降低 stat3 的磷 酸化水平。计算机分子对接试验初步结果表明，407 与 stat3 分子间有较强的 结合作用， 结合于stat3二聚化的sh2域。 而且407与stat3经典抑制剂stattic 联合应用具有拮抗作用。以上结果提示我们，407 可能是一个潜在的 stat3 活 性抑制剂。 1.4 本实验的研究目的 本论文在前期研究基础上，进一步研究海洋活性化合物 407 对 jak/stat3 通路上游信号分子及下游靶基因蛋白表达的影响，为进一步揭示其抗肿瘤活性 作用机制提供实验依据。 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 8 2 实验材料 2.1 细胞株 人结肠癌细胞株 hct-116，使用 dmem+10%胎牛血清培养细胞。细胞株 为医药学院分子药理学研究室保存所有。 使用浓度为 0.25%的胰酶消化传代细胞；培养环境为 37，5co2，饱和 湿度。 2.2 实验试剂 化合物 407 中国海洋大学天然产物化学二室顾谦群 教授课题组提供 胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司 dmem gibco（美国） 胰酶 sigama（美国） dmso amresco（美国） temed 生工生物工程(上海)股份有限公司 ecl 发光试剂 thermo（美国） stat3 epitomics（美国） p-stat3（tyr） epitomics（美国） p-stat3(ser) epitomics（美国） p-jak1 cell signaling（美国） p-jak1 cell signaling（美国） -actin抗体 santa cruz biotechnology（美国） survivin cell signaling（美国） mmp-9 cell signaling（美国） mcl-1 cell signaling（美国） vegf santa cruz biotechnology（美国） hrp-goat anti mouse antibody santa cruz biotechnology（美国） 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 9 kcl、nacl、na2hpo4、nahco3、异丙醇等试剂均为国产分析纯 2.3 实验仪器及耗材 co2 培养箱 heraeus（德国） 倒置相差显微镜 olympus（日本） 台式高速冷冻离心机 heraeus（德国） 血球计数板 beckman（美国） milliq ii 型纯水系统 millipore（美国） 超净工作台 heraeus（德国） legend micro17 台式离心机 thermo（美国） bp110s 电子天平 sartorius（德国） 微量加样器（移液器） eppendorf（德国） 硝酸纤维素膜（nc 膜） ge healthcare（美国） 半干转膜仪 大连竞迈医用光学器械厂 全能蛋白快速转印系统 bio-rad（美国） dyy-12 电泳仪 北京六一仪器厂 蛋白电泳系统 bio-rad（美国） 凝胶扫描成像及化学发光图像分析系统 protein simple（美国） 细胞培养瓶、6 孔细胞培养板 coastar（美国） 2.4 缓冲液及其他溶液配制: （1）pbs（磷酸盐缓冲液） ： 氯化钠 4g 氯化钾 0.1g na2hpo412h2o （na2hpo4） 1.44g （1.08g） kh2po4 0.1g 加双蒸水溶解定容至 500ml 配制： 过滤除去杂质， 细胞培养所用 pbs 在 0.068mpa 下高压灭菌 20min， 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 10 贮于 4冰箱保存。 （2）胰酶： 胰蛋白粉末 0.125g edta 0.01g pbs 定容 50ml 固体充分溶解后，室温放置 4 小时或 4过夜后过滤除菌，4冰箱保存。 （3）dmem 培养基： dmem 干粉一包 碳酸氢钠 1.719g 加注射用水至 500ml 配制：用 naoh(l) 1mol / l，hcl(l)1mol / l 调 ph 值，0.2m 滤膜过滤除 菌后装入已灭菌的瓶中。4下冰箱保存。 （4）30%丙烯酰胺-bis 溶液： 丙烯酰胺 29g 亚甲双丙烯酰胺 1g 双蒸水定容 100ml 配制：37溶解后，加避光过滤，4保存。 （5）10%sds： sds 固体粉末 20g 加双蒸水定容 200ml 充分溶解，室温保存。 （6）10过硫酸铵（aps） ： 过硫酸铵 20g 双蒸水溶解定容至 200ml 以每支 150l 分装与 0.5mlep 管中，-20冻存。 （7）4 上层浓缩胶缓冲液： trisbase 12g 加双蒸水至 200ml 溶解后用浓 hcl 调节至 ph6.8，4保存。 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 11 （8）4 下层分离胶缓冲液： trisbase 18.2g 双蒸水溶解定容至 100ml 浓 hcl 调节至 ph 8.8，4保存。 （9）2 loading buffer： 巯基乙醇 5ml 4 上层浓缩胶缓冲液 25ml 甘油 10ml 10%sds 30ml 溴酚蓝 20mg 双蒸水定容至 100ml 4保存。 （10）10 丽春红染液： 丽春红 2g 磺基水杨酸 30g 三氯乙酸 30g 加双蒸水至 100ml 室温保存。 （11）10半干转膜液： tris base 15g 甘氨酸（gly） 75g 双蒸水溶解定容至 500ml 4保存。 （12）10 蛋白电泳液： trisbase 15g 甘氨酸（gly） 72g sds 5g 双蒸水溶解定容至 500ml 4冰箱中保存，临用前用蒸馏水稀释成 1 蛋白电泳液使用。 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 12 （13）10 tbst 缓冲液： trisbase 12.1g nacl 40g tween-20 5ml 双蒸水溶解定容至 500ml 调节 ph 至 7.6，4冰箱中保存。 临用前用蒸馏水稀释成 1 tbst 缓冲液使用。 3 实验方法 3.1 细胞培养 将人结肠癌细胞株 hct-116 在 deme 与 10%胎牛血清混合的完全培养基中 培养，放在 37、5% co2培养箱中，等细胞长至 80%左右时或细胞培养液变黄 后进行细胞传代操作。 3.2 细胞传代 取出对数生长期的人结肠癌细胞株 hct-116 培养瓶，在超净工作台中弃去 原培养液， 用适量0.25%的胰酶洗2次； 留少量的胰酶于37培养箱中作用1-2min， 取出后倾斜培养瓶观察底部白色物质（细胞）是否随液体流动，流动则表明此时 细胞已经消化完成，立即放入超净工作台中加入约 3ml 含有 10%胎牛血清的 deme 培养液，用吹管轻轻吹打混匀（约吹 50 次）后用倒置显微镜下观察细胞 是否吹散为单个细胞，若已吹散细胞则弃去培养液留少量培养基，并加入 5ml 培养基置于 37、5%co2培养箱中培养；若没有吹散细胞则继续吹打细胞直至 吹成单个细胞继续操作。 3.3 细胞复苏 对照列表从液氮罐中取出细胞直接放在预先调好的 37水浴中，待融化后 放入离心机，以 1,000r/min 的转速离心 5min，弃掉上清，立即向冻存管加入 1ml 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 13 新鲜的含 10%gibico 血清的 dmem 培养基，吹匀，转移入新的培养瓶中，继 续加入新鲜含 10%gibico 血清的 dmem 培养基至 56ml。 3.4 细胞冻存 用90%含10% gibico血清的dmem培养基与10%的 dmso配置冻存液， ， 细胞长满后，采用传代的方式用吹管轻轻把细胞从壁上吹下，用吹管吹散为单个 细胞，然后将细胞悬液转移到 ep 管中 1,000g 离心 5min，弃掉上清，加入配好 的冻存液， 用吹管或移液枪吹匀， 移至冻存管中标记， 并放入冻存盒中， 放入-80 冰箱中过夜后转入液氮罐中长期保存。 3.5 407 对 stat3 相关信号通路的影响 3.5.1 蛋白样品制备 （1）取对数生长期的 hct-116 细胞，以 3 105/孔的密度将 2.7ml 细胞培养液接 种于 6 孔板中， 置于 37、 5%co2培养箱中培养 24h， 实验组每孔分别加入 0.3ml 终浓度为 0.125、0.25、0.5、1m l-1407，同时设置空白对照和溶剂对照组，置 于 37、5%co2的培养箱中培养适宜时间 1h。 （2）收集细胞，用 4预冷的已滤 pbs 洗三遍，加入细胞裂解液 100ml，冰上 裂解 40min 后每孔加入 25ml 5 loading buffer， 收集细胞裂解液于 0.5mlep 管中。 将样品放在沸水中煮沸 10min 后取出，待样品冷却后放在20冰箱中冻存。 3.5.2 western blotting 检测 （1）sds-page 凝胶电泳：根据要检测蛋白的分子量配制适宜电泳凝胶，待胶 凝固后将凝胶安装与垂直电泳槽中，并倒入蛋白电泳内液尽量加满电泳槽。样品 解冻后以 7500r/min 的转速离心 3min，每个样品约 10l 上样（后期实验根据显 影结果调节上样量） 于凝胶孔中， 同时使用已知蛋白质 marker 进行分子量对比。 （2）加样完毕后，将电泳槽放入电泳仪中，补充蛋白电泳内液使之加满，并倒 入一定量电泳外液。将电泳仪打开，将电压调为 80v 进行浓缩胶部分电泳，使 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 14 maker 条带分开，此过程约 40 分钟，随后，将电压设置为 120v，直至样品跑至 胶块底部。 （3）半干法转膜：待电泳结束后，以 70%双蒸水+20%甲醇+10%10 半干转膜液 配制转膜液，采用半干转膜法或快速转膜法将蛋白质从凝胶转移至 nc 膜上。 （4）丽春红染色：将转移蛋白后的 nc 膜置于丽春红染液中染色，待看到红色 的蛋白质条带，根据分子量将目的条带剪下并标记。 （5）封闭：用配置好的 tbst 洗涤三次以去掉丽春红，放在用 tbst 与奶粉配 制 5%的脱脂牛奶或封闭液中在摇床上低速摇匀，在室温条件下封闭 2-3h。 （6）一抗孵育：用 tbst 洗涤三次以去掉膜上多余牛奶及蛋白，加入 tbst 稀 释的相应检测蛋白的一抗（内参蛋白抗体-actin 稀释比例为 1:5000，其他抗体 稀释比例为1:1000） ： stat3 信号通路相关蛋白 stat3、 p-stat3、 p-jak1、 p-jak2 抗体，用保鲜膜封口后在 4 条件下低速摇床摇匀振荡孵育过夜。 （6）二抗结合：一抗回收，用 1 tbst 洗涤 4 6min。加入以 1:5000 用 tbst 稀释的二抗（hrp 标记的抗兔 igg） ，室温低速摇床摇匀振荡孵育 12h。 （7）蛋白检测：二抗回收，1 tbst 洗涤 4 6min，将 ecl 化学发光试剂 a 液 与 b 液 以 1:1 混合，滴加适量混合液于 nc 膜上，置于化学发光分析系统中， 进行曝光显影操作，观察结果并拍照保存。 3.6 407 对 stat3 靶基因表达产物含量的影响 细胞培养及药物处理同以上操作。药物作用 24h 后，同上方法对细胞进行裂 解处理并收样。western blotting 检测 stat3 靶基因表达产物 mcl-1、survivin、 vegf、mmp-9 的表达。 4 实验结果与讨论 western blot 法检测化合物 407 对 hct-116 细胞的作用 1h 后 stat3 信号通 路相关蛋白含量结果如表 2： 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 15 表 2 化合物 407 对 stat3 信号通路蛋白影响结果 time/h 1 1 1 1 1 1 407/ml-1 - - 0.125 0.25 0.5 1 dmso - 1/20000 - - - - stat3 92kd p-stat3（tyr） 92kd p-stat3（ser） 92kd p-jak1 130kd p-jak2 130kd -actin 43kd western blot 法检测化合物 407 对 hct-116 细胞的作用 24h，stat3 信号通 路下游靶基因表达产物含量结果如表 3： 表 3 化合物 407 对 stat3 信号通路下游基因表达影响结果 time/h 24 24 24 24 24 24 407/ml-1 - - 0.125 0.25 0.5 1 dmso - 1/20000 - - - - mcl-1 40kd survivin 18kd vegf 42kd mmp-9 84、 92kd -actin 43kd 根据前期研究结果显示， 407 在体外对人结肠癌细胞 hct-116 具有明显抑制 作用，ic50 仅为 0.18ml-1 ，并发现 407 可以抑制 stat3 磷酸化。为进一步确 定 407 的作用机制， 本论文先利用 western blot 法检测 407 对 hct-116 细胞作用 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 16 1h 后 stat3 活化过程中相关蛋白的影响。将 hct116 细胞接种于 6 孔板，贴壁 生长后，加入不同浓度 407 作用不同时间，收集细胞裂解液，western blot 检测 stat3 及 p-stat3、p-jak1、p-jak2 的表达。结果发现，407 对 stat3 的自身 表达无明显影响， 但可明显抑制 p-stat3 （tyr705） 的表达水平， 随着剂量增加， 抑制作用也增强 （表 2） 。 由上文可知， jak 更是上游多个酪氨酸激酶活化 stat3 的中间活化分子，其活性抑制将进而抑制下游信号分子的活化，但根据结果显示 407 对上游的 jak 的活化没有明显影响。 两个磷酸化的 stat3 分子形成二聚体后进入细胞核后，与核内下游靶基因 结合， 相应基因进行转录和表达， 其表达产物均与肿瘤细胞发生发展有重要联系， 因此本论文又用 western blot 法检测不同药物浓度的 407 对 hct-116 细胞作用 24h 后，stat3 信号通路下游靶基因表达产物 mcl-1、survivin、vegf、mmp-9 的影响，结果显示在这些下游蛋白中，与抑制细胞凋亡相关的蛋白 mcl-1 的含量 随药物浓度增加而减少，与促进细胞增殖有关的蛋白 survivin，血管生成相关蛋 白 vegf 含量和细胞转移相关的蛋白 mmp-9 与 407 浓度成反比（表 3） 。 5 结论 （1） 海洋来源活性化合物 407 对 stat3 信号通路上游 jak 分子活化无明显影 响。 （2） 化合物 407 可下调下游靶基因 mcl-1、 survivin、 vegf、 mmp-9 的表达。 海洋来源活性化合物 407 靶向 jak/stat3 的信号通路研究 17 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fluorouracilleucovorin as first-line