脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 【摘要摘要】 目的 分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法 在 无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含 10%胎牛血清 的 DMEM 培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞 生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果 采用 Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。 细胞生长曲线测定表明接后第 5 天细胞进入指数增生期，至第 9 天后数量减 少;流 式细胞检测表明 50%70%细胞为 CD29 和 CD45 阳性。结论 体外分离培养脐血 间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。 【关键词关键词】 脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed- cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下一定条件下具有多向分 化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理 学制 约的间充质干细胞成为近年来的研究热点1。脐血脐血(umbilical(umbilical cordcord blood,blood, UCB)UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB 来 源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中 也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出 MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研 究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值2,3。本研究将探讨人人 UCB-MSCsUCB-MSCs 体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面， 分析分析 UCB-MSCsUCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。作为间充质干细胞来源的可行性。 1 1 材料与方法材料与方法 1.1 UCB-MSCs 的分离与培养 9 份脐血标本均来源于辽宁医学院附属第一医院，均获得产妇同意。以等 量的 PBS 缓冲液混匀，缓慢滴入到等量的淋巴细胞分离液(Fercoll，1.073 g/mL,美国 Sigma 公司)，650650 g g 离心离心 1515 minmin。抽取白膜层细胞抽取白膜层细胞，以等量的 PBS 缓冲液洗涤离心，基础培养液基础培养液(DMEM/F12(DMEM/F12，10%10%胎牛血清、胎牛血清、100100 U/mLU/mL 青霉素和链青霉素和链 霉素、霉素、2 2 mmol/Lmmol/L L-L-谷氨酰胺谷氨酰胺) )重悬重悬，接种至 100 mm 培养皿，置于 37 、饱和 湿度、5%CO2 的培养箱内培养。第第 5 5 天首次全量换液天首次全量换液，之后每周 2 次换液，2 周 后达 60%80%融合时，0.25%胰酶(含 0.02%EDTA)常规消化传代。 1.2 UCB-MSCs 细胞表面抗原分析 分别取第分别取第 1 1、5 5、9 9 代细胞代细胞，胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。含 2%牛血清 白蛋白的 PBS 缓冲液冲洗细胞，室温下分别与 CD29-PE、 CD34-PE、CD44-PE 及 CD45-PE 单克隆抗体避光孵育避光孵育 15 min。PBS 缓冲液冲洗细胞，离心，弃上清。 加入含 1%多聚甲醛的 PBS 缓冲液 0.3 mL，使用同型对照单克隆抗体确定背景标 记，流式细胞仪分析细胞表面抗原流式细胞仪分析细胞表面抗原。 1.3 UCB-MSCs 体外增殖能力检测 分别取第 1、5、9 代细胞，胰蛋白酶消化，接种接种 2424 孔板孔板，每孔 1104 个 细胞/mL。胰酶消化并计数，每天计数 3 孔，绘制细胞的生长曲线。 1.4 细胞活性检测 分别取第 1、5、9 代细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞浓度至 1104 个细胞 /mL，每孔 100 L 接种于 96 孔板，在 37 、饱和湿度、5% CO2 的培养箱内 培养 2 天。向每孔加 MTT 溶液(5 mg/mL 用 PBS，pH=7.4 配制)10 L。继续孵 育 4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加 150 LDMSO，振荡 10 分钟，使结晶物充分融解。选择 490 nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各 孔光吸收值。 1.5 统计学处理 应用 SPSS 12.0 统计学软件处理，结果以均数标准差表示，采用配对 t 检验，P0.05)(P0.05)，但在第，但在第 9 9 代细胞的增殖活力稍下降，但差异不代细胞的增殖活力稍下降，但差异不 明显明显(P0.05)(P0.05)。 3 3 讨讨 论论 间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 具有多向分化潜能，是 组织工程研究中较为理想的种子细胞，是研究人工组织工程材料的必备条件。 安全、充足并不受伦理学制约的间充质干细胞来源是组织工程研究中要解决的 问题。以往的文献报 道和研究证实,骨髓作为 MSCs 的来源已经得到证实，并针 对骨髓源性的 MSCs 进行了一积极的探索4-6。但随着年龄的增加，骨髓中 MSCs 的含量明显减少11847-1861，且受病毒感染机会显著增加，获得骨髓的 过程也会造成一定的二次损伤，这些均限制了骨髓源性的 MSCs 的应用，寻找替 代的 间充质干细胞来源成为研究者关注的热点。有人认为脐血也有含有 MSCs，但随胚胎成就程度的不同 MSCs 的含量各不相同。但脐血是否存在 MSCs，并作为 MSCs 供源一直有争议7。支持者认为脐血与骨髓相比较，具有支持者认为脐血与骨髓相比较，具有 更充足的来源，且免疫原性低，能耐受更大程度更充足的来源，且免疫原性低，能耐受更大程度 HLAHLA 配型不符，分离出的配型不符，分离出的 MSCsMSCs 纯度更高纯度更高 8 。虽然脐血 MSCs 占脐血单个核细胞(mononuclear, MNC)的比例 较小，仅有约仅有约 25%25%的脐血样本的的脐血样本的 MNCMNC 含有并经培养后出现含有并经培养后出现 MSCsMSCs，但脐血，但脐血 MSCsMSCs 有有 85%85%以上处于细胞周期的以上处于细胞周期的 G0/GG0/G 期期99。因此，从 脐血中成功分离扩增出 MSCs，将作为一种新的 MSCs 的来源应用于科研和临床。 本实验采取密度梯度离心与直接贴壁法相结合密度梯度离心与直接贴壁法相结合，先用密度为先用密度为 1.0731.073 g/Lg/L 的的 淋巴细胞分离液对脐带血进行密度梯度离心，收获的中间层细胞中含有较多的淋巴细胞分离液对脐带血进行密度梯度离心，收获的中间层细胞中含有较多的 单个核细胞单个核细胞; ;再经反复贴壁培养和除去悬浮生长细胞，得到较多呈融合状态的贴 壁细胞。经经 MTTMTT 实验说明培养细胞有实验说明培养细胞有 9 9 代以前均具有良好的增殖能力代以前均具有良好的增殖能力，9 代后 稍下降。细胞的表面抗原检测发现细胞高表达细胞高表达 CD29CD29 和和 CD44CD44，但低表达，但低表达 C34C34 和和 CD45CD45，这与文献报道的一致10。一般认为，贴壁细胞中呈现成纤维细胞样形一般认为，贴壁细胞中呈现成纤维细胞样形 态，态， 具有旺盛的分裂增殖能力，且同时表达具有旺盛的分裂增殖能力，且同时表达 CD29CD29、CD44CD44，可以初步判断为是，可以初步判断为是 MSCs3MSCs3。本研究经分离纯化获得均一生长的长梭形或多角形贴壁细胞。本研究经分离纯化获得均一生长的长梭形或多角形贴壁细胞，经过 反复传代后贴壁细胞形态趋于均一，且细胞表型更为纯化，5070%的细胞表达 CD29、CD44，表明能从脐血中成功分离出 UCB-MSCs。本实验在 证明了脐血中 含有 MSCs 的同时，成功的对 UCB- MSCs 进行了扩增，进行了初步的鉴定和生物 学特征的检测，为 MSCs 进一步研究奠定了基础。 【参考参考文献文献】 1 Au A,Boehm CA,Mayes AM,et al. 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